錢(qián) 暢，薛思雯，徐幸蓮*，周光宏*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇高校肉類(lèi)生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

三聚磷酸鈉作為肉制品加工中常用的品質(zhì)改良劑，能通過(guò)改變體系電荷密度的方式促進(jìn)肌原纖維蛋白的溶解及肌纖維的橫向膨脹，從而提高肉及肉制品的保水性[1]；其還能水解產(chǎn)生焦磷酸鈉，從而使肌動(dòng)球蛋白解離并提高肌球蛋白的溶解度和提取率[2]。然而，有研究指出，過(guò)量攝入磷酸鹽會(huì)增加腎臟的代謝壓力并引發(fā)諸多疾病[3]。這就要求加工者在保持產(chǎn)品原有性狀的同時(shí)盡可能地降低三聚磷酸鈉的添加量。超高壓加工技術(shù)可以通過(guò)影響鹽離子對(duì)蛋白的修飾作用，促進(jìn)其溶解并增強(qiáng)其水合能力，從而降低肉制品中磷酸鹽的含量，但其作用效果受作用壓力及蛋白種類(lèi)的影響[4-5]，這說(shuō)明在高壓條件下磷酸鹽對(duì)蛋白的作用機(jī)制尚不清晰，需要進(jìn)一步研究。

保水性是評(píng)價(jià)肉及肉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，而肌球蛋白作為肌肉蛋白中占比最高（約25%）且唯一能形成熱凝膠的蛋白[6]，對(duì)此起決定性作用。單體肌球蛋白具有不對(duì)稱(chēng)的分子結(jié)構(gòu)（包含雙頭球狀、桿狀與尾部結(jié)構(gòu)域），其頭部有ATP酶的活性位點(diǎn)，尾部主要由α-螺旋組成[6]。在加熱過(guò)程中蛋白變性，分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，因聚合作用形成凝聚體，并最終交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而在此過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)程度、變性和聚集的速度以及多聚體之間的相互作用等均會(huì)影響有序凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，并最終改變凝膠的保水性[7]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)加入氯化鈉和磷酸鹽會(huì)分別使蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)變溫度明顯升高或降低，從而改變蛋白的熱穩(wěn)定性[8-9]。Speroni等[10]則發(fā)現(xiàn)三聚磷酸鈉對(duì)高壓肌球蛋白熱變性過(guò)程的影響會(huì)隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)和作用壓力的變化而變化。更有研究認(rèn)為加入到純肌球蛋白體系中的三聚磷酸鈉會(huì)改變蛋白的ATP酶活力[11]，從而影響蛋白的熱膠凝過(guò)程與形成凝膠的性質(zhì)。但具體作用方式仍缺乏合理解釋?zhuān)虼诉€需進(jìn)行細(xì)致深入的研究。

本研究對(duì)含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)三聚磷酸鈉的兔骨骼肌肌球蛋白進(jìn)行超高壓處理后程序升溫，篩選出對(duì)蛋白凝膠保水性有顯著影響的壓力參數(shù)與三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組合；在該條件下進(jìn)一步研究超高壓處理和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蛋白溶解度、ATP酶活力和升溫過(guò)程中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量、表面疏水性、活性巰基含量、靜態(tài)流變性及所形成熱凝膠的微觀結(jié)構(gòu)等理化特性的影響。探討凝膠保水性差異的形成原因及磷酸鹽在高壓肌球蛋白體系中的作用機(jī)制，為低磷酸鹽健康肉制品的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

3 月齡雄性新西蘭白兔（2.5～3.0 kg）江蘇省農(nóng)科院畜牧所；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽（adenosine triphosphate，ATP）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、超微量Ca2＋-ATP酶測(cè)定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；氯化鈉、焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀（均為分析純） 南京化學(xué)試劑公司；5,5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitroben-zoic acid，DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸（1-anilinonaphthalene-8-sulphonic acid，ANS）（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙烯真空包裝袋（20 ℃時(shí)透氧率為1 cm3/（m2·h）） 南京瑞翼特生物科技有限公司；MD44 36 mm透析袋（截留分子質(zhì)量為3 500 Da） 合肥新恩源生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waring高速組織搗碎機(jī) 美國(guó)思伯明設(shè)備有限公司；Ultra Turrax T25高速勻漿器 德國(guó)IKA公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼有限公司；MiniProtean3Cell小型垂直電泳槽、PowerPac Basic電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；TY-80s脫色搖床 南京大學(xué)南達(dá)生物技術(shù)有限公司；GT-800F凝膠成像系統(tǒng) 日本愛(ài)普生公司；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；MCR 301流變儀 奧地利Physica公司；Spectra Max M2酶標(biāo)儀 美國(guó)分子設(shè)備有限公司；圓二色光譜儀英國(guó)Applied Physics有限公司；S-IL-100-850-9-W高壓設(shè)備 英國(guó)Stansted Fluid Power公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取、檢測(cè)與蛋白樣品的制備

選用健康的新西蘭雄性白兔，宰前飲水和休息，減少應(yīng)激。機(jī)械擊昏后切斷頸部血管放血，迅速剝皮，去頭、爪及內(nèi)臟，自來(lái)水沖洗去除血跡。瀝干后放入4 ℃冰箱15 min，取腰大肌并剔除可見(jiàn)脂肪及結(jié)締組織，切碎。參照Cao Yingying等[12]的操作，于0～4 ℃下提取肌球蛋白，蛋白樣品采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行檢測(cè)分析。SDS-PAGE條件：分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，開(kāi)始電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓加大至120 V[13-14]，肌球蛋白純度的計(jì)算參照Laemmli[15]的方法，通過(guò)Quantity One軟件分析蛋白特征條帶的相對(duì)OD值。用雙縮脲法檢測(cè)肌球蛋白質(zhì)量濃度。

將蛋白樣品放入20 cm長(zhǎng)的透析袋中，分別置于含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0%、0.15%、0.30%、0.45%）三聚磷酸鈉的磷酸鹽緩沖液（1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）NaCl、20 mmol/L pH 6.5 KH2PO4/K2HPO4）與含0.30%三聚磷酸鈉的磷酸鹽緩沖液（2% NaCl、20 mmol/L pH 6.5 KH2PO4/K2HPO4）中4 ℃透析20 h，期間每7 h更換1 次透析液，共換3 次。透析完成后再用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液將蛋白樣品的質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至20 mg/mL。

1.3.2 蛋白樣品的超高壓處理及熱凝膠的制備

用真空包裝袋將高壓處理組的蛋白樣品封裝（每袋約50 mL，去除氣泡）。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究[16-17]得到的高壓參數(shù)，將蛋白樣品分別在100、200、300 MPa下保壓9 min，腔體溫度為25 ℃。對(duì)照組蛋白則置于常壓室溫（（25±1）℃）下9 min。超高壓處理完成后，將對(duì)照組和高壓處理組的蛋白溶液均置于0～4 ℃環(huán)境下12 h，待其狀態(tài)穩(wěn)定后再用10 mL離心管及玻璃燒杯盛裝，并置于水浴鍋中從20 ℃程序升溫（1 ℃/min）至85 ℃，保溫20 min。將凝膠置于0～4 ℃下過(guò)夜（12 h）。

1.3.3 蛋白溶解度的測(cè)定

參照Chen Xing等[18]的方法并略作改動(dòng)，用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液將靜置12 h后的蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，在4 ℃下以20 000×g離心20 min，用雙縮脲法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)量濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。蛋白溶解度按式（1）計(jì)算。

1.3.4 保水性的測(cè)定

參照Kocher等[19]的方法并作適當(dāng)改動(dòng)。準(zhǔn)確稱(chēng)量加入蛋白溶液前的離心管質(zhì)量（m1）及加入蛋白溶液后的總質(zhì)量（m2）。凝膠制備完成后，經(jīng)4 ℃、8 000×g離心10 min后去除水分，準(zhǔn)確稱(chēng)量余下質(zhì)量（m3），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。保水性按式（2）計(jì)算。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

凝膠樣品的制備參照徐幸蓮[6]的方法，用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛溶液（由25%戊二醛溶液用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液稀釋得到）固定48 h，用雙面刀片切成均勻小塊（3 mm×3 mm×2 mm），再用不同體積分?jǐn)?shù)（50%、70%、90%、95%、100%）的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，放入叔丁醇中置換3 次，每次30 min，再將其冷凍干燥并噴金（10 nm）。利用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察，加速電壓為10 kV，每個(gè)樣品觀察8 個(gè)區(qū)域。

1.3.6 ATP酶活力的測(cè)定

參照田金河[20]的方法，將蛋白樣品用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1 mg/mL，用超微Ca2＋-ATP酶測(cè)定試劑盒測(cè)定ATP酶活力，每個(gè)處理組均設(shè)置測(cè)定管和對(duì)照管，其中對(duì)照管在酶反應(yīng)結(jié)束后再加入蛋白樣品。根據(jù)試劑盒操作步驟，采用比色法在636 nm波長(zhǎng)處測(cè)定ATP酶解反應(yīng)產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷物質(zhì)的量，蛋白的ATP酶活力以ATP酶活力單位表示，即每毫克蛋白每小時(shí)分解產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷的物質(zhì)的量（μmol/（mg·h）），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 靜態(tài)流變特性的測(cè)定

參照Chen Xing等[18]的方法，將蛋白樣品用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液稀釋至5 mg/mL。儀器采用平行板（上板直徑50 mm），參數(shù)設(shè)置如下：頻率為0.1 Hz，應(yīng)變?yōu)?.01%，狹縫寬度為0.5 mm，從20 ℃以1 ℃/min升溫至80 ℃，記錄儲(chǔ)能模量（G’）的變化情況。

1.3.8 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的測(cè)定

參照薛思雯等[21]的方法，測(cè)定蛋白質(zhì)在升溫過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化。將蛋白樣品用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.3 mg/mL，在200～260 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量分子橢圓率，采用20～90 ℃程序升溫（1 ℃/min），計(jì)算25、40、55、70、85 ℃下肌球蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)卷曲）的含量。

1.3.9 表面疏水性的測(cè)定

參照Chen Xing等[18]的方法并作適當(dāng)修改，以ANS為熒光探針測(cè)定蛋白升溫過(guò)程中的表面疏水性變化。將蛋白樣品用相應(yīng)的磷酸鹽緩沖液稀釋至1 mg/mL，各取4 mL稀釋蛋白液加入10 mL離心管中，每個(gè)處理組含15 個(gè)樣品，用于在25、40、55、70、85 ℃下的表面疏水性測(cè)定。將樣品置于水浴鍋中，從20～85 ℃程序升溫（1 ℃/min），并在5個(gè)特定溫度下保溫5 min，后將對(duì)應(yīng)的樣品取出冰浴，防止溫度對(duì)蛋白的進(jìn)一步影響。向冷卻至室溫后的蛋白液中加入20 μL ANS溶液（15 mmol/L ANS溶解于0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），室溫下反應(yīng)20 min后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為375 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm條件下的熒光強(qiáng)度，以其表征蛋白的表面疏水性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.10 活性巰基含量的測(cè)定

參照Ellman[22]的方法并作適當(dāng)修改，利用DTNB測(cè)定蛋白升溫過(guò)程中的活性巰基含量變化，蛋白樣品制備及升溫過(guò)程同1.3.9節(jié)。向冷卻后的蛋白液中加入20 μL DTNB溶液（10 mmol/L DTNB溶解于0.1 mol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液）?；靹蚝笤诎堤? ℃反應(yīng)1 h，取上清液并用酶標(biāo)儀測(cè)定其在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并按式（3）計(jì)算蛋白中活性巰基的含量（C0），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

式中：A412nm為412 nm波長(zhǎng)處吸光度；ε為摩爾吸光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））；D為稀釋倍數(shù)；ρ為肌球蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE結(jié)果分析

如圖1所示，經(jīng)測(cè)定，肌球蛋白重鏈分子質(zhì)量約為207 kDa，3 條輕鏈的分子質(zhì)量分別為18.5、10 kDa和8 kDa，與文獻(xiàn)[23]的報(bào)道基本一致，經(jīng)Quantity One軟件分析計(jì)算，肌球蛋白純度約為83%。

圖1 肌球蛋白提取產(chǎn)物SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE prof i le of the extracted myosin from rabbit skeletal muscle

2.2 凝膠保水性結(jié)果分析

圖2 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白熱凝膠保水性的影響Fig.2 Effects of UHP and STPP content on WHC of heat-induced myosin gels

肌肉蛋白凝膠的保水性能夠直接影響重組類(lèi)肉制品的感官特性和出品率，是衡量產(chǎn)品品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[24]。從圖2中可以看出，經(jīng)100、200 MPa超高壓處理的蛋白加熱后形成的凝膠的保水性較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），在300 MPa時(shí)則大幅下降（P＜0.05），這與曹瑩瑩等[25]的研究結(jié)果相符。作用于蛋白的外部壓力會(huì)影響其分子形態(tài)和分子間的相互作用，并改變其凝膠形成過(guò)程。有研究報(bào)道，200 MPa以下的超高壓處理會(huì)促進(jìn)蛋白構(gòu)象的展開(kāi)與分子間作用力的形成，強(qiáng)化蛋白與水間的相互作用[26]；而300 MPa以上的超高壓處理會(huì)使蛋白過(guò)度變性，弱化其凝膠形成能力，導(dǎo)致凝膠保水性下降[16]。

含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa超高壓處理后加熱形成的凝膠的保水性顯著下降（P＜0.05）。但隨著三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%，凝膠保水性再次上升，且高于未添加三聚磷酸鈉的處理組，此后無(wú)顯著變化（P＞0.05）。徐幸蓮[6]則發(fā)現(xiàn)三聚磷酸鈉僅在質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)0.75%以上時(shí)才會(huì)起到提高凝膠保水性的作用。改善凝膠保水性所需的三聚磷酸鈉添加量的差異可能是超高壓處理以及試劑添加方式上的不同所致。蛋白凝膠的保水性與蛋白的溶解度、分子間作用力以及凝膠的微觀結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，加入到純肌球蛋白體系中的磷酸鹽對(duì)體系環(huán)境和蛋白熱膠凝過(guò)程的影響可能改變凝膠結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致凝膠保水性的變化[27]。隨著三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，經(jīng)300 MPa處理的蛋白加熱形成的凝膠的保水性也持續(xù)上升，可能是劇烈的壓力作用改變了蛋白頭部亞基結(jié)構(gòu)[16]，磷酸鹽對(duì)蛋白的作用機(jī)制同時(shí)也發(fā)生變化。

在100～300 MPa的壓力范圍內(nèi)，蛋白凝膠的保水性隨著三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0%升高到0.30%不斷變化，說(shuō)明在此過(guò)程中蛋白的理化特性及熱凝膠的形成過(guò)程也明顯改變，此后三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高則對(duì)保水性無(wú)顯著影響（P＞0.05）。故選擇0%、0.15%、0.30%作為三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)因素的3 個(gè)水平，從蛋白的功能特性和分子結(jié)構(gòu)角度進(jìn)行深入研究，探討凝膠保水性差異的形成原因。

2.3 蛋白溶解度結(jié)果分析

圖3 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白溶解度的影響Fig.3 Effects of UHP and STPP content on solubility of myosin

肌球蛋白是一種鹽溶蛋白，在高鹽濃度下呈可溶狀態(tài)[28]。超高壓處理可以通過(guò)影響鹽離子對(duì)蛋白的修飾作用促進(jìn)其溶解，從而增強(qiáng)其凝膠能力[29]。從圖3中可以看出，未添加三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa處理后，其溶解度較對(duì)照組顯著上升（P＜0.05），這與Yamamoto等[30]的研究結(jié)果相符。但加入了0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)超高壓處理后，其溶解度較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）。徐幸蓮[6]也報(bào)道了在低離子強(qiáng)度體系中，加入0.25%三聚磷酸鈉會(huì)導(dǎo)致溶液濁度顯著上升。當(dāng)三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%時(shí)，蛋白的溶解度再次上升，并顯著高于未添加三聚磷酸鈉的處理組（P＜0.05），其中以經(jīng)100 MPa超高壓處理的含0.3%三聚磷酸鈉的蛋白的溶解度最高。這說(shuō)明當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，三聚磷酸鈉會(huì)呈現(xiàn)出對(duì)高壓促溶效應(yīng)的拮抗作用。而隨著添加量的增大，這種拮抗作用逐漸消失，蛋白的親水作用加強(qiáng)，溶解度提高。當(dāng)壓力升高到300 MPa時(shí)，蛋白的溶解度顯著下降（P＜0.05）。這與文獻(xiàn)[31]的報(bào)道相符，說(shuō)明劇烈的壓力作用加劇了疏水基團(tuán)的暴露[32]，疏水相互作用的增強(qiáng)促進(jìn)了蛋白分子的聚集[33]。

2.4 ATP酶活力結(jié)果分析

圖1 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)高壓肌球蛋白ATP酶活力的影響Fig.1 Effects of UHP and STPP content on ATPase activity of myosin

肌球蛋白的ATP酶活力與其構(gòu)象緊密相關(guān)，故常作為衡量蛋白變性程度的一項(xiàng)指標(biāo)[34]。從圖4中可以看出，與對(duì)照組相比，經(jīng)超高壓處理后未添加三聚磷酸鈉的蛋白的ATP酶活力顯著降低（P＜0.05），且隨著作用壓力的升高不斷下降，300 MPa時(shí)各處理組蛋白的ATP酶活力接近于0。這與Yamamoto[35]和Iwasaki[36]等的研究結(jié)果相符，說(shuō)明超高壓處理會(huì)使肌球蛋白的ATP酶活力降低乃至喪失。ATP酶的結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白頭部的S-1亞基上，其活性中心是半胱氨酸的巰基[24]，超高壓處理破壞了蛋白的天然結(jié)構(gòu)，促使其頭部亞基解離并在疏水作用的參與下進(jìn)一步聚集[26]。這會(huì)導(dǎo)致酶的結(jié)合位點(diǎn)或活性中心被包裹或遮蔽，其活力也隨之下降[35]。300 MPa時(shí)蛋白ATP酶活力的喪失也說(shuō)明其頭部變性的程度較高，與前人的研究結(jié)果[17]吻合。

含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa超高壓處理后，其ATP酶活力顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.15%）的三聚磷酸鈉對(duì)超高壓誘導(dǎo)蛋白頭部變性有拮抗作用。但三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%后，蛋白的ATP酶活力顯著下降（P＜0.05），說(shuō)明蛋白頭部的變性程度再次增大。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ATP和三聚磷酸鈉均能與肌球蛋白頭部S-1亞基結(jié)合[27,37]，且兩者的磷酸基團(tuán)連接方式相同，具有結(jié)構(gòu)相似性[38]。Blum[39]認(rèn)為三聚磷酸鈉可能與肌球蛋白的ATP酶位點(diǎn)間存在特異性結(jié)合，并能改變其ATP酶活力。Xiong Youling L.等[2]則認(rèn)為ATP酶具有水解三聚磷酸鈉的能力。Jin Hongguo等[40]發(fā)現(xiàn)肌球蛋白的S-1亞基同時(shí)具有ATP酶和三聚磷酸酶活力，但兩者的活性中心并不相同，且三聚磷酸酶的活力更高。綜合已有的研究及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推測(cè)在三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，它會(huì)與三聚磷酸酶的活性中心發(fā)生特異性結(jié)合；但由于三聚磷酸鈉與ATP的結(jié)構(gòu)相似，處于同一結(jié)構(gòu)域的ATP酶的活性位點(diǎn)同時(shí)也會(huì)被誘導(dǎo)暴露或活化，從而導(dǎo)致ATP酶活力的升高。隨著三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，多余的三聚磷酸鈉無(wú)法與相應(yīng)的酶位點(diǎn)結(jié)合并水解（受位點(diǎn)數(shù)量及水解反應(yīng)速率的限制）[11,41]，只能發(fā)生電離，因此體系的離子強(qiáng)度增大且pH值升高。林麗軍[42]的研究顯示肌球蛋白的ATP酶活力在低離子強(qiáng)度和pH 5.5環(huán)境中達(dá)到最高，但隨著離子強(qiáng)度和pH值的升高而下降，故蛋白的ATP酶活力在三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%時(shí)再次下降。

2.5 表面疏水性和活性巰基含量結(jié)果分析

表1 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白升溫過(guò)程中表面疏水性的影響Table1 Effects of UHP and STPP content on surface hydrophobicity of myosin during heating

表2 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白升溫過(guò)程中活性巰基含量的影響Table2 Effects of UHP and STPP content on reactive sulfhydryl group content of myosin during heating

疏水基團(tuán)和巰基在肌球蛋白受熱變性凝聚的過(guò)程中起重要作用[6]。表1、2分別顯示了高壓肌球蛋白在升溫過(guò)程中疏水基團(tuán)和包埋巰基基團(tuán)的暴露情況?？梢钥闯觯c對(duì)照組相比，經(jīng)超高壓處理后未添加三聚磷酸鈉的蛋白在加熱前（25 ℃）的表面疏水性和活性巰基含量均顯著升高（P＜0.05），且隨著壓力的增大呈上升趨勢(shì)。這與前人的研究結(jié)果一致[12]，壓力作用會(huì)導(dǎo)致部分維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的非共價(jià)鍵斷裂，暴露出包埋的氨基酸殘基。含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa處理后，其表面疏水性和活性巰基含量顯著低于其他兩組（P＜0.05），說(shuō)明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三聚磷酸鈉會(huì)拮抗超高壓處理對(duì)蛋白分子構(gòu)象的改變。Fernández-Martin等[43]也認(rèn)為磷酸鹽的加入會(huì)削弱高壓處理后蛋白分子間形成的疏水相互作用。隨著三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步升高，蛋白在加熱前的表面疏水性和活性巰基含量再次顯著上升（P＜0.05），說(shuō)明磷酸鹽對(duì)超高壓處理的拮抗作用逐漸消失，蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

當(dāng)溫度升高到40 ℃后，100、200 MPa各處理組蛋白的表面疏水性和活性巰基含量均呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），但變化速率仍有差別。在40～55 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)，100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組蛋白的表面疏水性和活性巰基含量的變化速率最高（分別為20.23 ℃－1和13.92 μmol/（100 mg·℃））；200 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組其次。而100 MPa 0.15%三聚磷酸鈉和200 MPa 0.15%三聚磷酸鈉處理組的變化速率則是同壓力處理組中最低的，且其蛋白的的表面疏水性和活性巰基含量在55 ℃后無(wú)顯著變化（P＞0.05）。這說(shuō)明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三聚磷酸鈉會(huì)抑制高壓肌球蛋白在加熱過(guò)程中的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化以及疏水基團(tuán)和隱藏巰基的暴露；而三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高促進(jìn)了升溫過(guò)程中蛋白高級(jí)構(gòu)象的展開(kāi)及所包埋基團(tuán)的暴露。這也是蛋白形成具有良好保水性的凝膠的關(guān)鍵[7,16]，在溫度和氧化劑的作用下，蛋白分子間形成疏水相互作用，暴露的巰基也被氧化成二硫鍵[12]。這有助于蛋白凝聚體及有序凝膠結(jié)構(gòu)的形成，大量的水分子被吸引并被包裹在三維凝膠網(wǎng)絡(luò)中[16]，凝膠的保水性因此上升。300 MPa時(shí)各處理組蛋白的表面疏水性和活性巰基含量在加熱過(guò)程中無(wú)明顯變化，說(shuō)明超高壓處理使蛋白過(guò)度聚集，抑制了蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)疏水基團(tuán)和巰基的暴露[16]。

2.6 超高壓作用壓力、三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)間的交互作用情況

由表3可知，超高壓作用壓力對(duì)加熱前的蛋白溶解度以及最終熱凝膠保水性有顯著影響（P＜0.05），對(duì)其他指標(biāo)有極顯著影響（P＜0.01）；三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)則對(duì)所有指標(biāo)有極顯著影響（P＜0.01）。這與Villamonte等[4]報(bào)道的結(jié)果相符，說(shuō)明超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化均會(huì)改變高壓肌球蛋白的空間構(gòu)象，引起蛋白分子間化學(xué)作用力的變化，從而影響所形成凝膠的保水性，而兩者間的交互作用對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)也均有極顯著影響（P＜0.01），說(shuō)明不同壓力條件下三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)改變引起的蛋白性質(zhì)變化也不盡相同。

表3 超高壓作用壓力、三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其交互作用對(duì)肌球蛋白的理化性質(zhì)和凝膠保水性的影響Table3 Effects of UHP, STPP content and their interaction on physicochemical properties of myosin and WHC of formed gel

2.7 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分析

從表4可以看出，在加熱前（25 ℃），經(jīng)超高壓處理的未添加三聚磷酸鈉的肌球蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且隨著作用壓力的升高不斷降低。而含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa處理后，其α-螺旋結(jié)構(gòu)含量較不含三聚磷酸鈉的處理組顯著上升（P＜0.05），但在三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.30%后再次下降（P＜0.05）。壓力作用帶來(lái)的體積壓縮會(huì)削弱維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵和離子鍵，導(dǎo)致其含量不斷下降[44]。有報(bào)道稱(chēng)三聚磷酸鈉對(duì)此有拮抗作用[43]。但隨著三聚磷酸鈉添加量的升高，離子強(qiáng)度增大，蛋白尾部分子鏈展開(kāi)，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量再次減小[45]。

隨著溫度不斷上升，各處理組蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量均顯著降低（P＜0.05），而β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲含量隨之升高，其中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量在40～55 ℃間的變化幅度最大。在此區(qū)間內(nèi)，100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的下降速率最高（1.41%/℃），200 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組次之（1.36%/℃），而100 MPa 0.15%三聚磷酸鈉和200 MPa 0.15%三聚磷酸鈉處理組蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量雖呈現(xiàn)類(lèi)似的變化趨勢(shì)，但其下降速率降低，說(shuō)明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三聚磷酸鈉會(huì)抑制加熱過(guò)程中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。曾淑薇等[46]的研究發(fā)現(xiàn)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%以上的磷酸鹽會(huì)促進(jìn)蛋白的溶解，增大蛋白分子間空間距離，從而加速蛋白尾部的解螺旋。而蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變也促進(jìn)了其高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，并導(dǎo)致蛋白表面疏水性和活性巰基含量的變化。300 MPa時(shí)各處理組蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量在升溫過(guò)程中的變化幅度減小，說(shuō)明蛋白的熱敏性降低，蛋白尾部的解折疊程度也下降。這可能與此壓力條件下蛋白的過(guò)度聚集有關(guān)[33]。

表1 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白升溫過(guò)程中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Table1 Effects of UHP and STPP content on the contents of secondary structures of myosin during heating

2.8 蛋白流變特性分析

圖5 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白升溫過(guò)程中G’（A）及其變化速率（B）的影響Fig.5 Effects of UHP and STPP content on G’ （A） and the rate of change in G’ （B） during heating

從圖5可以看出，未添加三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa處理后G’和變化速率dG’/dT的首個(gè)峰值溫度較對(duì)照組均上升了2～3 ℃，這與Liu Gang等[47]的研究結(jié)果相符，說(shuō)明超高壓處理使蛋白頭部的變性凝聚過(guò)程延后，這促進(jìn)了該部分結(jié)構(gòu)域的展開(kāi)，有助于蛋白頭部亞基的相互結(jié)合與聚集[26]。因此G′的首個(gè)峰值較對(duì)照組有所提升。

含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白經(jīng)100、200 MPa超高壓處理后再加熱，G’與dG’/dT的首個(gè)峰值溫度較未添加三聚磷酸鈉的處理組上升了3 ℃，且G’與dG’/dT的首個(gè)峰值也明顯降低，說(shuō)明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三聚磷酸鈉提升了蛋白頭部結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[48-49]報(bào)道了三聚磷酸鈉對(duì)肌球蛋白熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)作用，其多表現(xiàn)為增加最大熱吸收峰的溫度及變性焓值。Speroni等[10]認(rèn)為這種保護(hù)作用源于磷酸根離子的Hofmeister效應(yīng)及其與肌球蛋白頭部ATP酶位點(diǎn)的特異性結(jié)合；Henry[50]和Shriver[51]等的研究則顯示磷酸鹽會(huì)提高蛋白的ATP酶活力并抑制其頭部受熱變性，從而影響蛋白進(jìn)一步的凝集。三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%時(shí)，G’與dG’/dT的首個(gè)峰值溫度再次下降，且G’與dG’/dT的首個(gè)峰值均得到回升，這與Speroni等[10]的研究結(jié)果相符，說(shuō)明蛋白頭部的熱變性得以恢復(fù)乃至被促進(jìn)。這可能是因?yàn)槿哿姿徕c的特異性結(jié)合位點(diǎn)飽和，其電離出的磷酸根離子與蛋白側(cè)鏈上的帶電基團(tuán)結(jié)合，破壞了離子鍵，導(dǎo)致蛋白的熱穩(wěn)定性降低[11]。隨著溫度升高到55 ℃，100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉和200 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組蛋白的G’逐漸降低，dG’/dT也出現(xiàn)負(fù)峰。說(shuō)明蛋白尾部結(jié)構(gòu)域的變性打破了之前形成的初步交聯(lián)結(jié)構(gòu)，蛋白的彈性模量下降[52]。但此時(shí)蛋白尾部結(jié)構(gòu)的充分解折疊會(huì)促進(jìn)接下來(lái)的尾-尾交聯(lián)，故60 ℃后含0.30%三聚磷酸鈉的蛋白的dG’/dT高于含0.15%三聚磷酸鈉的蛋白。100 MPa 0.30%三聚磷酸鈉處理組蛋白的最終G′最高，說(shuō)明其形成的凝膠結(jié)構(gòu)儲(chǔ)存彈性形變能量的能力最強(qiáng)。

經(jīng)300 MPa處理的蛋白在40～55 ℃間無(wú)G’及dG’/dT的正峰，說(shuō)明其頭部聚集及弱凝膠形成的階段消失，這可能與過(guò)高的壓力導(dǎo)致蛋白頭部的聚集能力受損有關(guān)[53]。該壓力條件下三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化對(duì)G’及dG’/dT的峰值、首個(gè)峰值溫度以及蛋白的最終G’無(wú)明顯作用。結(jié)合前文ATP酶活力的結(jié)果，推測(cè)蛋白頭部天然構(gòu)象被破壞從而導(dǎo)致磷酸鹽的特異性結(jié)合位點(diǎn)消失是其主要原因。

2.9 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

圖6 超高壓作用壓力和三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)肌球蛋白熱凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of UHP and STPP content on microstructure of heat-induced myosin gels

圖6 是利用掃子顯微描電鏡觀察的高壓肌球蛋白熱凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。可以看出，經(jīng)100 MPa超高壓處理的未添加三聚磷酸鈉的蛋白加熱后形成的凝膠由許多絲狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)而成，與對(duì)照組相比，其結(jié)構(gòu)中的網(wǎng)孔大小及分布較為均勻，這也與Wang Mengyao等[54]的研究結(jié)果一致。而隨著0.15%三聚磷酸鈉的加入，原本有序的凝膠結(jié)構(gòu)變得雜亂，其中有形狀不規(guī)則的大孔洞，表面也出現(xiàn)斷裂的絲狀結(jié)構(gòu)。文獻(xiàn)[27]顯示低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三聚磷酸鈉會(huì)促進(jìn)蛋白凝聚成交聯(lián)軸而非顆粒，使交聯(lián)軸變粗、變大，孔洞增大，凝膠微觀結(jié)構(gòu)的致密性下降。而當(dāng)三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%時(shí)，有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)再次形成，且其中包含了疊加的次級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這使蛋白分子與水相的整體接觸面積變大，蛋白與水之間的相互作用也得到增強(qiáng)；凝膠中的大量小孔徑結(jié)構(gòu)還能有效地束縛水分[55]，故凝膠的保水性得到改善，凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)彈性形變的應(yīng)力提高。Jao等[56]的研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)超過(guò)50%的ATP酶失活時(shí)，高壓肌球蛋白能夠形成良好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這也與前文ATP酶活力的結(jié)果一致。三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.30%的肌球蛋白經(jīng)100、200 MPa超高壓處理后，其溶解度和ATP酶活力改變，升溫過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)域充分展開(kāi)并形成交聯(lián)，促進(jìn)了分子間相互作用力的形成。這有利于有序凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，并最終使凝膠的保水性得到提升。

3 結(jié) 論

不同壓力條件下的超高壓處理和蛋白體系中三聚磷酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均會(huì)影響肌球蛋白的結(jié)構(gòu)與溶解度、ATP酶活力等理化特性，并改變其熱膠凝過(guò)程中的變性速率及交聯(lián)方式，最終導(dǎo)致凝膠保水性的變化。100、200 MPa超高壓處理后，含0.15%三聚磷酸鈉的肌球蛋白的溶解度顯著下降，ATP酶活力顯著上升（P＜0.05）。低質(zhì)量分?jǐn)?shù)三聚磷酸鈉呈現(xiàn)出對(duì)超高壓處理的拮抗作用，蛋白在升溫過(guò)程中的分子構(gòu)象變化也受抑制。而隨著三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高到0.30%，拮抗作用消失，升溫過(guò)程中蛋白的結(jié)構(gòu)充分展開(kāi)，疏水基團(tuán)與所包埋的巰基快速暴露，蛋白連結(jié)形成有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠的保水性也顯著上升（P＜0.05）。而300 MPa超高壓處理會(huì)使蛋白的溶解度大幅下降（P＜0.05），ATP酶活力喪失，蛋白在升溫過(guò)程中的變性與解折疊程度低，形成的分子間交聯(lián)弱，最終導(dǎo)致凝膠保水性的顯著下降（P＜0.05）。