李 坤，張雯雯，劉蘭香，鄭 華，李 凱，徐 涓，張 弘

（中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

紫膠是紫膠蟲分泌的一種天然樹脂混合物[1-2]，主要由紫膠樹脂、紫膠蠟和紫膠色素組成[3-5]。紫膠樹脂是由紫膠桐酸為代表的羥基脂肪酸和殼腦酸為代表的倍半萜烯酸所組成的內(nèi)酯與交酯[6-9]。紫膠樹脂以其優(yōu)良的成膜性、黏結(jié)力、抗鹽霧、耐水等性能而廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、軍工、涂料等行業(yè)[10-15]。將紫膠樹脂中的內(nèi)酯與交酯鍵破壞后，經(jīng)系列提取、純化工藝即得紫膠桐酸[16-18]。紫膠桐酸，即9,10,16-三羥基十六烷酸，化學(xué)式為C16H32O5，是一種白色晶體[19-21]。紫膠桐酸是一種具有重要應(yīng)用價值的多羥基脂肪酸，目前主要用于香料工業(yè)中香貓酮、二氫香貓酮、大環(huán)麝香類化合物的合成，亦可作為前列腺素、昆蟲信息素、環(huán)酰脲等物質(zhì)的合成原料[22-24]。目前，有關(guān)紫膠桐酸的研究大多關(guān)注的是其作為化學(xué)純長鏈羥基脂肪酸本身的價值[25-27]，立體結(jié)構(gòu)及其相關(guān)的性質(zhì)及應(yīng)用研究則少有涉及。從結(jié)構(gòu)上看，紫膠桐酸9位與10位均為手性羥基，且無中心對稱軸，因此理論上存在2 組對映異構(gòu)體，雖有國外學(xué)者注意到了蘇式與赤式構(gòu)型間的部分差異，但研究并未深入[28]。顯然，明確紫膠桐酸的立體構(gòu)型對于促進(jìn)其深度開發(fā)和利用有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatographyevaporative light-scattering detector，HPLC-ELSD）法，建立紫膠桐酸立體異構(gòu)體的拆分和檢測條件，并從熱力學(xué)角度探索其手性拆分的機(jī)理和規(guī)律，以期為光學(xué)純紫膠桐酸的拆分檢測和色譜法制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

顆粒紫膠 昆明西萊克生物科技有限公司；紫膠桐酸參考文獻(xiàn)[16]中方法制備，按照文獻(xiàn)[20]方法檢測，實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Promptar公司；（±）-紫膠桐酸混旋體標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%） 美國Sigma公司；氫氧化鈉（分析純） 西隴化工有限公司；氯化鈉（分析純） 天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純） 廣東光華科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型HPLC儀、1260B型ELSD 美國安捷倫科技有限公司；色譜柱DAICEL CHIRAL PAK IF（25 cm×0.46 cm i.d.，5 μm） 大賽璐藥物手性技術(shù)（上海）有限公司；AB204-S精密型電子天平 瑞士梅特勒-托利多（中國）有限公司；DSC200F3差示掃描量熱儀 德國Nestch公司；高純氮?dú)猓兌取?9.999%）、液氮 昆明梅塞爾氣體有限公司；Tensor-27傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 紫膠桐酸對映體拆分方法的建立

流動相組成：以甲醇、乙腈、水為流動相組分，分別測定流動相組成為0.1%甲酸-甲醇（20∶80，V/V）、0.1%甲酸-乙腈（50∶50，V/V）、乙腈-甲醇（50∶50，V/V）溶液時，紫膠桐酸對映體的手性拆分效果。

流動相比例：根據(jù)上述確定的流動相組成，設(shè)定流動相比例（V/V）為20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30，根據(jù)色譜出峰時間，分別按照文獻(xiàn)[29]的方法計(jì)算容量因子k1、k2，分離因子α及分離度Rs，以便評價對比拆分效果。

柱溫：在上述確定的最佳流動相組成和流動相比例條件下，分別設(shè)置柱溫為10、15、20、25、30、35、40 ℃，根據(jù)出峰時間，分別按照文獻(xiàn)[29]的方法計(jì)算容量因子k1、k2，分離因子α及分離度Rs，以便評價對比拆分效果。

線性關(guān)系考察：配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的紫膠桐酸混旋體貯備液備用。采用稀釋法準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品。在上述確定的最佳條件下，以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分別建立2 個對映體的回歸方程，以回歸方程系數(shù)R2檢驗(yàn)2 個對映體在指定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。

重復(fù)性考察：配制0.5 mg/mL的混旋體樣品，重復(fù)進(jìn)樣3 次，分別計(jì)算2 個對映體峰的峰面積及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

穩(wěn)定性考察：配制0.5 mg/mL的混旋體樣品，分別在0、4、8、12、24、36、48 h時進(jìn)樣，分別計(jì)算2 個對映體峰的峰面積及RSD。

1.3.2 紫膠桐酸對映體含量與ee值測定

在最佳拆分條件下，配制0.5 mg/mL的混旋體樣品，采用峰面積歸一法測定制備所得紫膠桐酸對映體的相對含量，并按公式（1）計(jì)算對映體過量值（ee值）：

式中：[a]為過量的對映體相對含量/%；[b]為另一個對映體的相對含量/%。

1.3.3 紫膠桐酸手性拆分熱力學(xué)研究

根據(jù)1.3.1節(jié)中柱溫對紫膠桐酸對映體拆分效果的影響，結(jié)合范特霍夫（Van’t Hoff）方程與阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程，說明所選手性色譜柱和填料類型與紫膠桐酸對映體的拆分機(jī)理和特性。

1.3.4 紫膠桐酸樣品表征

1.3.4.1 差示掃描量熱對比分析

差示掃描量熱測試條件：取紫膠桐酸樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，以空坩堝為參比，初始溫度為0 ℃，終止溫度為200 ℃，升溫速率10 ℃/min，恒溫10 min，以保證試樣吸熱充分和基線平穩(wěn)。加熱過程均在吹掃氣和保護(hù)氣（均為高純N2，其中吹掃氣流速20 mL/min，保護(hù)氣流速50 mL/min）的條件下進(jìn)行，降溫介質(zhì)為液氮。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜對比分析

取紫膠桐酸樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，壓片基質(zhì)為溴化鉀，壓力10 MPa，紅外掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm－1，分辨率4 cm－1，累計(jì)掃描32 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)計(jì)算及整理采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行，作圖及分析采用Origin 8.0.6軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-ELSD法拆分紫膠桐酸對映體

2.1.1 流動相組成對分離效果的影響

圖1 流動相組成對紫膠分離效果的影響Fig.1 Influence of mobile phase composition on separation efficiency

在色譜分析中，水、甲醇、乙腈作為常用流動相，結(jié)合紫膠桐酸在水和甲醇中的溶解性，以及乙腈的強(qiáng)極性，本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-甲醇、乙腈-甲醇3 種流動相考察流動相組成對拆分效果的影響。取3 種流動相比例均為50∶50（V/V）為例，在45 min洗脫時間內(nèi)，如圖1所示，0.1%甲酸-乙腈溶液的洗脫峰良好；乙腈-甲醇溶液的結(jié)果顯示兩峰分離度太小，洗脫過快；而0.1%甲酸-甲醇溶液的組成在120 min內(nèi)無法洗脫，經(jīng)實(shí)際測試將比例調(diào)為0.1%甲酸-甲醇溶液為20∶80且進(jìn)樣量增大1 倍時，洗脫峰出現(xiàn)，可見0.1%甲酸-甲醇溶液的組成對紫膠桐酸樣品的洗脫能力相對較弱。綜上，采用0.1%甲酸-乙腈的流動相組成時，紫膠桐酸樣品可在30 min內(nèi)洗脫完畢，且分離度良好。

2.1.2 流動相比例對分離效果的影響

表1 流動相比例對紫膠桐酸手性拆分參數(shù)的影響Table 1 Influence of formic acid to acetonitrile ratio on resolution parameters of aleuritic acid enantiomers

圖2 流動相比例對分離效果影響Fig.2 Influence of formic acid to acetonitrile ratio on separation efficiency

由表1可以看出，隨著流動相中極性較強(qiáng)組分乙腈含量的減小，容量因子k1和k2及分離度Rs先減小后增大；分離因子α均大于1.5，則說明所有流動相組成條件下，紫膠桐酸中2 個樣品峰均實(shí)現(xiàn)了基線分離。如圖2所示，在0.1%甲酸（A）-乙腈（B）比例為40∶60及30∶70時，2 個對映體分離度、峰形都較好，且在20 min內(nèi)完成洗脫，時間較短，均達(dá)到了對映體拆分的要求。盡管在流動相比例為30∶70時，樣品的容量因子更小，但2 個對映體峰的分離度較40∶60時小，考慮到較寬的分離度有利于后續(xù)即將開展的制備過程，故而選擇0.1%甲酸-乙腈體積比40∶60作為最佳流動相比例。

2.1.3 柱溫對分離效果的影響

表2 柱溫對紫膠桐酸手性拆分參數(shù)的影響Table2 Influence of column temperature on resolution parameters of aleuritic acid enantiomers

圖3 柱溫對分離效果影響Fig.3 Influence of column temperature on separation efficiency

如表2所示，隨著柱溫的升高，2 個對映體的容量因子及分離因子均呈現(xiàn)較為明顯的下降趨勢，這說明隨著溫度的升高，樣品在固定相中的保留能力在逐漸減弱，這與Van’t Hoff方程與Arrhenius方程中，升高溫度有利于加快溶質(zhì)與固定相間的吸附和解吸過程的表述一致，而體現(xiàn)在色譜的分離參數(shù)中，即為容量因子k和分離因子α的減小。但如圖3所示，在10～40 ℃的柱溫范圍內(nèi)，紫膠桐酸2 個對映體均實(shí)現(xiàn)了良好的基線分離，且當(dāng)溫度大于25 ℃時，不僅將分離時間縮短在了20 min以內(nèi)，樣品峰的峰高、峰形也更好。可見，在建立分析方法時，較高的柱溫有利于分離分析時取得較好的效果，而當(dāng)以色譜法拆分制備樣品時，適當(dāng)降低柱溫則可提高2 個對映體的分離度絕對值，以便于提高收集樣品時的得率和純度。綜合表2及圖3的結(jié)果來看，綜合考慮分離效果并鑒于較低溫度下儀器能耗較低、色譜柱壽命長、升溫時間更短的原則，此處選擇30 ℃作為最佳分離柱溫。

2.1.4 線性方程的建立

將2 個對映體所得峰面積作為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，第1個對映體峰1的樣品質(zhì)量濃度與峰面積間的線性方程為y=1 183.3x－229.38，R2=0.990 2，第2個對映體峰2的樣品質(zhì)量濃度與峰面積間的線性方程為y=773.2x－166.1，R2=0.990 4，表明通過HPLC-ELSD法繪制的紫膠桐酸對映體標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，即在所選色譜分離條件下，2 個對映體峰均呈現(xiàn)出良好的線性比例關(guān)系。

2.1.5 方法重復(fù)性結(jié)果

表3 紫膠桐酸2 個對映體線性關(guān)系的重復(fù)性考察Table3 Repeatability of the method

如表3所示，在建立的手性拆分條件下，2 個紫膠桐酸對映體峰峰面積的RSD分別為0.88%和1.9%，說明紫膠桐酸2 個對映體在所建立檢測條件下均呈現(xiàn)出了良好的可重復(fù)性。

2.1.6 樣品穩(wěn)定性結(jié)果

表4 紫膠桐酸2 個對映體樣品的穩(wěn)定性考察Table4 Stability of the method

如表4所示，紫膠桐酸2 個對映體峰在48 h內(nèi)的RSD分別為1.2%和1.5%，說明在建立的手性拆分條件下，紫膠桐酸樣品可在至少48 h內(nèi)得到穩(wěn)定的分離和檢測。

2.1.7 2 個對映體含量及ee值

表5 紫膠桐酸2 個對映體相對含量及ee值Table5 Enantiomer composition and enantiomeric excess value of aleuritic acid

由表5可知，在上述確定的最佳條件下，以0.5 mg/mL質(zhì)量濃度試樣對制備紫膠桐酸進(jìn)行對映體含量測定時，峰1與峰2的相對含量分別為65.5%和34.5%，紫膠桐酸混旋體的ee值為31%，說明堿法制備所得紫膠桐酸光學(xué)純度較低。可見，在對紫膠桐酸立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度開發(fā)時，對映體樣品的拆分及制備顯得很有必要。

2.2 紫膠桐酸手性拆分熱力學(xué)研究結(jié)果

根據(jù)2.1.3節(jié)中柱溫對紫膠桐酸對映體拆分效果的影響結(jié)果，為進(jìn)一步揭示紫膠桐酸手性拆分過程中，對映體與固定相間手性識別過程中的微觀相互作用，依據(jù)參考文獻(xiàn)[30-31]可用色譜參數(shù)表示如下：

式（2）、（3）中：k為容量因子；α為分離因子；R為氣體常數(shù)；?為流動相中乙腈與0.1%甲酸溶液間的體積比值；ΔH、ΔS分別為紫膠桐酸對映體在流動相與固定相間分配過程中的焓變和熵變；ΔΔH、ΔΔS為紫膠桐酸2 個對映體在流動相與固定相間分配過程中的焓變與熵變之差。

假設(shè)紫膠桐酸對映體和固定相的作用機(jī)理在本實(shí)驗(yàn)所研究的溫度范圍內(nèi)不發(fā)生改變，則lnk和lnα對分離溫度的倒數(shù)1/T作圖時均應(yīng)呈線性關(guān)系，其斜率分別為－ΔH/R和－ΔΔH/R。依據(jù)表2結(jié)果，以lnα方程為例，其線性方程如圖4所示。

圖4 lnα與1/T間的線性關(guān)系方程Fig.4 lnα versus 1/T plot for enantiomeric separation of aleuritic acid

根據(jù)圖4，由式（3）可求得：ΔΔH為－3 453.0 J/mol，ΔΔS為－7.677 6 J/mol，ΔΔH與ΔΔS均為負(fù)值，則說明紫膠桐酸的對映體分離過程受焓變控制，而其轉(zhuǎn)折溫度Tiso=ΔΔH/ΔΔS=449.7 K，說明紫膠桐酸2 個對映體手性拆分的轉(zhuǎn)折溫度為449.7 K，即理論上，在本實(shí)驗(yàn)的分離條件下，柱溫高于449.7 K時，紫膠桐酸的2 個對映體不能實(shí)現(xiàn)分離，由此可見，本實(shí)驗(yàn)所選固定相對紫膠桐酸對映體在較高的溫度區(qū)間均有較高的對映選擇性。從分離過程來看，紫膠桐酸對映體在IF柱上的分離是因?yàn)椴煌淖夏z桐酸對映體與手性固定相間的微觀相互作用有差異所致。從熱力學(xué)角度來看，紫膠桐酸不同對映體與固定相間生成的非對映絡(luò)合物具有不同的能焓，能焓越大，絡(luò)合物在固定相上的保留作用越強(qiáng)，對映體間這種保留作用的差異使得化合物有著不同的洗脫順序，并最終實(shí)現(xiàn)分離，一般認(rèn)為當(dāng)ΔΔH差值大于500 J/mol時，對映體間即能實(shí)現(xiàn)基線分離[32]，紫膠桐酸對映體間實(shí)際焓差ΔΔH為－3 453.0 J/mol，這也是紫膠桐酸對映體能夠在較寬溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離的原因。ΔΔS則表示的是紫膠桐酸對映體與固定相相互作用過程中的熵變，熵變越大，說明紫膠桐酸對映體與固定相間的絡(luò)合作用越強(qiáng)，即對固定相的有序結(jié)構(gòu)利用的越充分，也就越容易實(shí)現(xiàn)拆分。

表6 紫膠桐酸中2 個對映體峰的lnk對1/T的線性方程Table6 lnk versus 1/T equations for enantiomer peaks of aleuritic acid

從表6中l(wèi)nk與1/T的方程可求得，峰1的ΔH1為10 623.6 J/mol；ΔS1為－36.42 J/mol；峰2的ΔH2為14 076.4 J/mol，ΔS2為－44.09 J/mol。顯然，2 個對映體峰的ΔH、ΔS值與出峰順序一致，亦從側(cè)面證明了熵變、焓變的熱力學(xué)理論在解釋紫膠桐酸對映體分離過程中的合理性。

2.3 紫膠桐酸樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的傅里葉變換紅外光譜分析

圖5 紫膠桐酸制備樣品與標(biāo)準(zhǔn)品傅里葉變換紅外光譜對比圖Fig.5 Comparative FTIR spectra of prepared and standard samples of aleuritic acid

用于拆分的紫膠桐酸均為參照文獻(xiàn)[16-17,19]制備，為進(jìn)一步說明拆分結(jié)果的準(zhǔn)確性，將制備樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖對比，如圖5所示。可見二者紅外吸收特征峰完全一致，進(jìn)一步說明制備樣品確為紫膠桐酸的混旋體?，F(xiàn)將其主要特征吸收峰歸屬如下：在3 306 cm－1為羥基中O－H的伸縮振動峰；在2 935 cm－1和2 848 cm－1處為CH3和－CH2－的伸縮振動特征峰；在1 725 cm－1處的峰為C＝O的伸縮振動峰；在1 467 cm－1和1 367 cm－1處的2 個峰分別為－CH2－的剪式振動和面外搖擺振動；在1 403 cm－1處的峰為羧酸－OH變形振動；在1 128 cm－1和1 087 cm－1處的2 個峰為醇的伸縮振動；在721 cm－1處的峰為－CH2－變形振動，而且亞甲基數(shù)目在4 個以上。

2.4 紫膠桐酸提取樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的差示掃描量熱分析

圖6 制備紫膠桐酸樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的差示掃描量熱曲線對比圖Fig.6 Comparison of DSC curves of prepared and standard samples of aleuritic acid

如圖6所示，制備紫膠桐酸樣品與紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品相比，無明顯的雜質(zhì)熱吸收峰，二者差示掃描量熱曲線表現(xiàn)出了較高的一致性，制備紫膠桐酸樣品的熔融峰值溫度為97.3 ℃，紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品為99.8 ℃；從終止溫度來看，制備紫膠桐酸樣品的熔融峰值溫度為99.7 ℃，紫膠桐酸標(biāo)準(zhǔn)品為101.8 ℃，如圖7所示，這與文獻(xiàn)報道的強(qiáng)堿皂化法所得紫膠桐酸為蘇式結(jié)構(gòu)對映體的結(jié)果一致[22]。造成這種差異的原因可能是二者的純度有差異且樣品的結(jié)晶度不同所致。

圖7 紫膠桐酸光學(xué)異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式及對映關(guān)系Fig.7 Structures and enantiomeric relationship of optical isomers of aleuritic acid

3 結(jié) 論

采用HPLC-ELSD法，考慮不同條件下的流動相組成、流動相比例、柱溫等因素，確定紫膠桐酸對映體的最佳拆分的HPLC條件：色譜柱DAICEL CHIRAL PAK IF（25 cm×0.46 cm i.d.，5 μm），流速0.5 mL/min；流動相為0.1%甲酸-乙腈（40∶60，V/V）溶液，柱溫為30 ℃；ELSD檢測器條件：蒸發(fā)室溫度70 ℃，漂移管溫度60 ℃，載氣（高純氮）流速1.6 L/min。

采用強(qiáng)堿皂化法所得化學(xué)純紫膠桐酸通過HPLCELSD拆分可見，其中主要有2 種光學(xué)對映體，且為蘇式結(jié)構(gòu)的對映異構(gòu)體，其相對含量分別為65.5%和34.5%，ee值為31%。紫膠桐酸手性拆分的熱力學(xué)研究結(jié)果顯示：lnα與lnk與1/T均呈良好的線性關(guān)系，R2分別為0.997 2、0.995 1和0.998 0；2 個對映體焓變與熵變之差ΔΔH為－3 453.0 J/mol和ΔΔS為－7.677 6 J/mol，均為負(fù)值，說明紫膠桐酸的拆分過程受焓控制，且IF柱的改性纖維素基硅膠填料對紫膠桐酸的蘇式對映體有著較強(qiáng)的拆分能力。傅里葉變換紅外光譜及差示掃描量熱曲線則進(jìn)一步說明了強(qiáng)堿提取紫膠桐酸樣品與標(biāo)準(zhǔn)品一致，均為紫膠桐酸立體異構(gòu)的蘇式混旋體，即蘇式構(gòu)型的對映異構(gòu)體。