張慧婷 婁 閣

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤的首位。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，因此在很大程度上限制了對卵巢癌的早期預(yù)防及臨床診療。近年來，隨著研究的不斷深入，腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)相關(guān)研究領(lǐng)域取得了飛速的進(jìn)展，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。TME通過各種機(jī)制參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、免疫抑制和炎性反應(yīng)的過程。體外建立卵巢癌研究模型，可用于觀察卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥機(jī)制，可為卵巢癌的治療找到新的靶點(diǎn)和方法，甚至如何早期預(yù)防卵巢癌。傳統(tǒng)的體外卵巢癌研究模型是通過對卵巢癌細(xì)胞系的單層培養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)，盡管這種單層培養(yǎng)模型在早期很大程度上幫助我們對卵巢癌發(fā)病機(jī)制得以了解，但由于單一的培養(yǎng)環(huán)境，以及缺乏與疾病發(fā)生進(jìn)展相關(guān)的一些因素的協(xié)同變化，如侵襲、多細(xì)胞相互作用等，并不能完全真實(shí)的反映體內(nèi)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。應(yīng)運(yùn)而生的三維培養(yǎng)模型模擬了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，因而能更好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，對于研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制具有重要作用。在卵巢癌三維培養(yǎng)模型的研究工作中，已經(jīng)建立了大量的細(xì)胞培養(yǎng)模型，如人間皮瘤模型、腹水中癌細(xì)胞的三維器官模型、類器官三維模型、移植體培養(yǎng)模型、球狀細(xì)胞系模型。本文就當(dāng)前卵巢癌TME三維細(xì)胞培養(yǎng)模型及其在研究中的潛力及面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述。

1 卵巢癌TME及三維模型的建立

從腫瘤發(fā)生到開始轉(zhuǎn)移，卵巢癌細(xì)胞與周圍環(huán)境基質(zhì)成分之間密切的相互作用產(chǎn)生復(fù)雜而變化的TME[1]。TME的基質(zhì)成分包括腫瘤血管和淋巴管(包括內(nèi)皮細(xì)胞和外皮細(xì)胞)、間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白[2-3]。卵巢癌具有獨(dú)特的TME，大量活化的間皮細(xì)胞覆蓋在腹膜腔內(nèi)，網(wǎng)膜的脂肪細(xì)胞是播散轉(zhuǎn)移的首選靶點(diǎn)，其次腹水的微環(huán)境包括直接動(dòng)力學(xué)作用，影響并維持腹水中腫瘤細(xì)胞的獨(dú)特表型和侵襲行為，促進(jìn)卵巢癌的增殖、轉(zhuǎn)移與播散；相反卵巢癌的發(fā)生發(fā)展亦可促進(jìn)腹水中基質(zhì)成分的波動(dòng)與變化，并刺激基質(zhì)成分分化為親腫瘤表型進(jìn)一步促進(jìn)卵巢癌進(jìn)展、介導(dǎo)免疫逃逸與治療耐性。所有這些變化都與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的特定方向有關(guān)，然而傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無法準(zhǔn)確捕捉到它們的波動(dòng)。在三維微環(huán)境中的癌細(xì)胞培養(yǎng)比傳統(tǒng)的二維系統(tǒng)更能代表疾病的發(fā)生過程。三維系統(tǒng)[4]提供了：(1)一種結(jié)構(gòu)上類似于體內(nèi)環(huán)境的條件，并且能夠適應(yīng)氧和生長因子的梯度變化；(2)細(xì)胞和細(xì)胞之間，細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之間介導(dǎo)的通信得以保留[5]。卵巢癌進(jìn)展包括癌細(xì)胞從輸卵管或卵巢原位癌腫瘤中剝離，以單細(xì)胞或球形細(xì)胞種植到腹膜腔，并附著于大網(wǎng)膜和(或)腸道表面。卵巢癌的復(fù)雜性和異質(zhì)性意味著體外模型的開發(fā)，對于再現(xiàn)體內(nèi)病理生理特征是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。在當(dāng)前的回顧中，我們關(guān)注最新的利用原代基質(zhì)細(xì)胞的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型[6]，特別是大網(wǎng)膜間皮瘤的三維模型和微流體模型[7]。我們提供了這些模型的概述，這兩個(gè)模型都用于研究卵巢癌轉(zhuǎn)移的早期過程，描述了細(xì)胞和非細(xì)胞成分、機(jī)械力的改變以及應(yīng)用[8]。

2 卵巢癌TME的三維模型

2.1 人間皮瘤三維模型

建立三維間皮瘤模型，闡明特定的細(xì)胞和非細(xì)胞成分，即成纖維細(xì)胞、HPMCs和不同的ECM蛋白在早期卵巢癌轉(zhuǎn)移到大網(wǎng)膜中的作用[9]。將這種間皮瘤模型與其他3D培養(yǎng)物區(qū)分開來的兩個(gè)關(guān)鍵因素：(1)在構(gòu)建模型之前，作者分析了正常網(wǎng)膜活組織檢查的蘇木精和伊紅染色，以形成正常網(wǎng)膜生理框架的最佳圖像；(2)模型包括了兩種類型的原代基質(zhì)細(xì)胞，即HPMC和成纖維細(xì)胞。在手術(shù)過程中從新鮮的大網(wǎng)膜活檢中提取出原發(fā)的HPMC和成纖維細(xì)胞，在體外重建卵巢癌TME。將人大網(wǎng)膜成纖維細(xì)胞植入ECM中，并覆蓋一層HPMCs(成纖維細(xì)胞與HPMCs比例為1∶5)。隨著卵巢癌細(xì)胞或卵巢表面上皮干細(xì)胞的加入，這種高重復(fù)性的構(gòu)建被用來確定每個(gè)TME成分，包括不同的ECM蛋白在卵巢癌黏附和侵襲過程中的作用。模型結(jié)果表明，HPMCs和成纖維細(xì)胞在這些過程中都起著關(guān)鍵作用。不同ECM蛋白的模型結(jié)果顯示，與玻璃體結(jié)合蛋白、纖連蛋白或?qū)诱尺B蛋白相比，存在膠原的卵巢癌細(xì)胞黏附和侵襲性最強(qiáng)。該模型還作為卵巢癌領(lǐng)域其他科學(xué)家的研究資源[10]。這種間皮瘤模型已經(jīng)在許多出版物中被使用，進(jìn)一步闡明了早期卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。自定義間皮瘤模型的功能使其在高通量篩選(HTS)試驗(yàn)中達(dá)到重塑和利用。通過進(jìn)一步優(yōu)化孵育時(shí)間、電鍍順序、卵巢癌細(xì)胞數(shù)量、HPMCs、成纖維細(xì)胞、ECM等參數(shù)，得到了可用于重復(fù)使用384-和1536-的HTS檢測模型[11]。完全自動(dòng)化的3D HTS檢測技術(shù)為篩選可能靶向卵巢癌早期黏附/侵襲或增殖的小分子抑制劑提供了幫助。NCATS研究了LOPAC1280對卵巢癌黏附/侵襲或增殖的藥理活性化合物。這些檢測隨后進(jìn)行驗(yàn)證性、計(jì)數(shù)性和次生生物檢測，利用人體間皮瘤的三維模型來識(shí)別鉛化合物。最終，在不同的異種移植模型中驗(yàn)證了先導(dǎo)化合物對卵巢癌轉(zhuǎn)移的抑制活性。在皮膚黑素瘤的研究中，2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)模型的藥物反應(yīng)也有差異。這些研究報(bào)道了腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(TRAIL)聯(lián)合UVB或UVB聯(lián)合順鉑在2D培養(yǎng)中殺死了黑色素瘤細(xì)胞，但只有TRAIL加上順鉑組合在其三維類器官皮膚黑色素瘤球體模型中才有效。這些差異進(jìn)一步凸顯了三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的價(jià)值，該模型可以更進(jìn)一步的表示卵巢癌TME的復(fù)雜性。這種間皮瘤模型是再現(xiàn)卵巢癌轉(zhuǎn)移微環(huán)境的第一步，但它仍然缺乏其他的體內(nèi)因素，如血管、脂肪細(xì)胞和宿主免疫細(xì)胞。然而，它代表了一個(gè)明顯比單層二維培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，以分析腫瘤發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制和潛在的新療法。

2.2 腹水中癌細(xì)胞的三維器官模型

卵巢癌球狀體的腹膜擴(kuò)散及其與網(wǎng)膜間皮細(xì)胞的相互作用不是一個(gè)靜態(tài)的過程。隨著腹水量的增加所產(chǎn)生水的直接動(dòng)力作用在培養(yǎng)三維模型時(shí)亦要考慮在內(nèi)。隨后創(chuàng)建的卵巢癌TME模型中，Li等[12]開發(fā)了基于3D微流體的活細(xì)胞注入微米大小細(xì)胞腔的模型。這些模型支持精確的控制細(xì)胞微環(huán)境，允許生長因子或營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)刺激及梯度變化。在Li等將間皮細(xì)胞表達(dá)在纖連蛋白上，并添加熒光標(biāo)記卵巢癌球狀體追蹤其在連續(xù)流態(tài)下模擬卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)的腹膜液流動(dòng)活動(dòng)。Carroll等[13]在2018年發(fā)表的一篇論文通過對癌癥的研究又增加了另一層復(fù)雜性交替激活的巨噬細(xì)胞(AAMs)、間皮細(xì)胞和卵巢之間的相互作用及癌細(xì)胞在動(dòng)態(tài)流體實(shí)驗(yàn)中卵巢癌細(xì)胞的黏附。研究者首先在靜態(tài)3D條件下，確定AAM分泌的巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1誘導(dǎo)間皮細(xì)胞系中p-選擇素的表達(dá)，從而增加卵巢癌細(xì)胞黏附于間皮細(xì)胞的發(fā)生。采用模擬流體的平行板流動(dòng)室后由于對細(xì)胞的壓力太大，研究者繼續(xù)證明了間皮細(xì)胞p-選擇素的增加系導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞流動(dòng)增強(qiáng)的原因。與在靜力條件下的實(shí)驗(yàn)相比，流動(dòng)條件下的實(shí)驗(yàn)條件提供了更有價(jià)值的分析，經(jīng)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移不可能在標(biāo)準(zhǔn)二維靜態(tài)培養(yǎng)中復(fù)制。雖然這些微流體三維模型只包含一種基質(zhì)細(xì)胞類型，但它們的模型化意味著它們可以被設(shè)定、被實(shí)驗(yàn)物理化控制以用來研究包括其他基質(zhì)細(xì)胞或ECM組件用于功能性研究如黏附、侵入和擴(kuò)散等。

2.3 類器官三維模型

卵巢癌患者和BRCA突變攜帶者的輸卵管移植物中前體病變的識(shí)別作為高級(jí)別漿液性卵巢癌的可能起源位點(diǎn)[14]，但是輸卵管TME尚未得到很好的探索。目前體外類器官培養(yǎng)的材料可來源于多能干細(xì)胞(Human pluripotent stem cells，hPSCs)或成體干細(xì)胞(Somatic stem cells)[15]。其中多能干細(xì)胞可來源于胚胎干細(xì)胞(Ebryonic stem cells，ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotentstem cells，iPSCs)，而成體干細(xì)胞則一般來源于手術(shù)取材后的組織標(biāo)本的分離與提純。利用生長因子和基質(zhì)細(xì)胞重建TME，成功培養(yǎng)了輸卵管上皮干細(xì)胞。體外輸卵管類器官模型現(xiàn)已可從誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中產(chǎn)生定向細(xì)胞。原發(fā)性輸卵管上皮細(xì)胞通過條件作用介質(zhì)，自我組成具有纖毛和分泌功能成分的輸卵管管腔結(jié)構(gòu)。類化合物不含任何基質(zhì)成分，但可與類有機(jī)物結(jié)合培養(yǎng)，系統(tǒng)研究類器官中細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用的微環(huán)境。進(jìn)一步研究集中于通過改造的輸卵管上皮模型細(xì)胞在類器官中不斷的增殖，并整合成一種器官模型模擬早期卵巢癌TME研究。

2.4 移植體培養(yǎng)模型

雖然不是傳統(tǒng)意義上的模型培養(yǎng)，但是移植體培養(yǎng)可保持患者組織的原始結(jié)構(gòu)、微環(huán)境特點(diǎn)和異質(zhì)性，代表了另一種形式的三維模型。以卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)人網(wǎng)膜和輸卵管外植體5天[16]，并最終揭示卵巢癌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到輸卵管。此外，這些外植體也可以用來測試不同藥物或治療方法的效果，以及其對卵巢癌黏附、遷移、侵襲和增殖的影響。

2.5 球狀細(xì)胞系模型

對于大多數(shù)研究卵巢癌TME的研究人員來說，這些非器官模型的建立是為了研究原發(fā)性卵巢癌TME在體外培養(yǎng)情況下的各成分變化[17]。目前許多不包括原代細(xì)胞的有研究價(jià)值的三維模型已經(jīng)成功推廣并用于功能測定。這些非器官模型包括在合成基質(zhì)、ECM、低黏附塑板、懸液或旋轉(zhuǎn)燒瓶上進(jìn)行卵巢癌球狀細(xì)胞系培養(yǎng)。雖然這些三維模型缺乏一個(gè)最主要的基質(zhì)細(xì)胞組件，但它們的多組件概念比在平鋪板上的單層細(xì)胞更大程度上接近TME。在大量的相關(guān)研究闡明了耐藥機(jī)制后，表明它們可以作為藥物預(yù)測的臨床模型。

3 小結(jié)與展望

建立卵巢癌TME三維模型的主要目的就在于盡可能模擬人體內(nèi)環(huán)境，更精確地闡明卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制[18]。模型開發(fā)的每個(gè)階段都是一項(xiàng)重要且艱巨的一步，而目前的模型在實(shí)際應(yīng)用中與實(shí)際情況并不完全接近于TME。最終，卵巢癌腫瘤三維模型的目標(biāo)是包含但簡化體內(nèi)人類微環(huán)境。通過在體外模擬不同的TMEs，我們可以闡明TME其作用及在卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性和耐藥性轉(zhuǎn)化中的影響，及更有效的卵巢癌預(yù)防措施和更加精準(zhǔn)的診斷和治療方法，更好的服務(wù)于患者和臨床。