孫梁琨 冉娜 胡琦蘭

[摘要]目的 探討替芬泰對(duì)HepG2 A64細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響。方法 選取HepG2 A64耐藥細(xì)胞株作為研究對(duì)象，根據(jù)有無(wú)使用替芬泰將其分為觀察組與對(duì)照組，觀察組采用抗乙型肝炎病毒（HBV）效果較好的劑量122.5 μg替芬泰，對(duì)照組除不加替芬泰外，其余處理同觀察組。應(yīng)用基因芯片的方法，檢測(cè)并分析兩組HepG2 A64細(xì)胞中的基因表達(dá)水平。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，觀察組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞比較，許多基因的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，編碼基因中表達(dá)差異10倍以上的基因有11個(gè)，分別為：ZNF503反義RNA 1（ZNF503-AS1）、絲氨酸肽酶抑制劑Kazal 4型（SPINK4）、白介素21受體（IL-21R）、鈣與整合素結(jié)合家族成員4（CIB4）、糖蛋白NMB（跨膜）（GPNMB）、CELF2反義RNA 2（CELF2-AS2）、酸性磷酸酶5（ACP5）、含有7B的kelch域（KLHDC7B）、突觸結(jié)合蛋白4（SYT4）、MRPL23反義RNA 1（MRPL23-AS1）、智人H19印跡母系表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本（H19），其中IL-21R與免疫相關(guān);把差異表達(dá)倍數(shù)在1.5倍以上的基因取出，應(yīng)用KEGG通路分析，有9個(gè)，分別為：層粘連蛋白β3（LAMB3）、腫瘤壞死因子（TNF）、周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A（p21）、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤2（Bcl2）、周期蛋白依賴(lài)激酶6（CDK6）、轉(zhuǎn)錄激活因子4（CERB）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白酪氨酸激酶2（Pyk2）、小鼠骨肉瘤病毒致癌基因同源（FOS），參與HBV感染相關(guān)分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而通過(guò)干預(yù)胞內(nèi)信號(hào)通路鈣依賴(lài)性酪氨酸激酶-2（Calcium-Pyk2）傳導(dǎo)發(fā)揮體外抗HBV作用。結(jié)論 替芬泰可通過(guò)調(diào)控HBV復(fù)制下游Calcium-Pyk2信號(hào)通路和p21因子，從而對(duì)HBx蛋白的功能產(chǎn)生影響，達(dá)到抑制HBV復(fù)制的作用，并可通過(guò)影響細(xì)胞IL-21、Bcl2等免疫因子，提高細(xì)胞抗HBV作用。

[關(guān)鍵詞]替芬泰片;HepG2 A64細(xì)胞;基因水平;表達(dá)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R322.47 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1674-4721（2019）12（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Tifentail on gene expression in HepG2 A64 cells. Methods HepG2 A64 drug-resistant cell line was selected as the research object. In the observation group， 122.5 μg Tifentai （the dose with better anti-hepatitis B virus [HBV] effect） was used， and another blank control group was used. The control group was treated the same as the observation group except for the absence of Tifentail. Gene chip was used to detect and analyze gene expression in two groups of HepG2 A64 cells. Results The results showed that compared with the control group， the expression of many genes in the observation group was up-regulated or down-regulated， and there were eleven genes with the expression difference of more than 10 times in the coding genes， ZNF503 antisense RNA 1 （ZNF503-AS1）， serine peptidase inhibitor Kazal type 4 （SPINK4）， interleukin 21 receptor （IL-21R）， calcium and integrin binding family member 4 （CIB4）， glycoprotein （transmembrane） NMB （GPNMB）， CELF2 antisense RNA 2 （CELF2-AS2）， acid phosphatase 5 （ACP5）， kelch domain containing 7B （KLHDC7B）， synaptotagmin Ⅳ （SYT4）， MRPL23 antisense RNA 1 （MRPL23-AS1）， homo sapiens H19 imprinted maternally expressed transcript （H19） respectively. Among them， IL-21R was associated with immunity. The genes with differentially expressed multiples of 1.5 times or more were extracted and analyzed by KEGG pathway， laminin β3 （LAMB3）， tumor necrosis factor （TNF）， cyclin-dependent kinase inhibitor 1A （p21）， B-cell CLL/lymphoma 2 （Bcl2）， cyclin-dependent kinase 6 （CDK6）， activating transcription factor 4 （CERB）， protein kinase C γ （PKC）， protein tyrosine kinase 2 β （Pyk2）， murine osteosarcoma viral oncogene homolog （FOS） respectively. They were involved in the molecular regulatory network related to HBV infection， and thus play an anti-HBV role in vitro by interfering with intracellular signaling pathway calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2 （Calcium-Pyk2） conduction. Conclusion Tifentail can inhibit HBV replication by regulating Calcium-Pyk2 signaling pathway and p21 factor downstream of HBV replication， and enhance the anti-HBV effect of cells by influencing immune factors such as IL-21 and Bcl2.

[Key words] Tefentail Tablets; HepG2 A64 cells; Gene level; Expression

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是引起乙型肝炎（簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝）的病原體[1]，全世界約有20多億人正在感染過(guò)或者感染過(guò)HBV，慢性乙型肝炎患者己超過(guò)4億人。我國(guó)的HBV感染率較高，全國(guó)感染過(guò)HBV的有50%～70%，其中慢性乙肝患者約有60%[2]。因此，降低HBV的感染率、加快對(duì)乙型肝炎的臨床治療和新藥研發(fā)已刻不容緩。近年來(lái)，我國(guó)的中草藥馬蹄金（貴州苗藥，旋花科，別名黃疽草，在廣西、四川又稱(chēng)“小金錢(qián)草”）在治療乙型肝炎上得到了很好地利用，馬蹄金主治急、慢性肝炎、黃疽型肝炎、膽囊炎等癥[3]。而從馬蹄金中分離得到的替芬泰是具有抗乙肝病毒活性的單體馬蹄金素的衍生物，抗HBV的活性強(qiáng)[4]。

在替芬泰作用機(jī)制的研究初期，筆者對(duì)HBV復(fù)制環(huán)節(jié)的幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行研究。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，首先替芬泰對(duì)HBV聚合酶并沒(méi)有明顯的抑制活性，表明替芬泰的抗病毒機(jī)制不同于核苷（酸）類(lèi)似物。其次，筆者從病毒復(fù)制環(huán)節(jié)并未找到替芬泰抑制HBV DNA的作用靶點(diǎn)，推測(cè)替芬泰可能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)達(dá)到抗病毒的作用，并且作用于病毒宿主相互作用的多個(gè)靶點(diǎn)。于是筆者從細(xì)胞整體水平進(jìn)行研究，選用HepG2 A64耐藥細(xì)胞株作為研究對(duì)象，應(yīng)用基因芯片的方法，通過(guò)宿主自身的功能調(diào)節(jié)尋找其抗HBV的作用位點(diǎn)。本研究將考察替芬泰對(duì)HepG2 A64細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響，旨在尋找替芬泰抗HBV的作用位點(diǎn)，為抗HBV藥品研發(fā)提供更多參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

HepG2A64細(xì)胞：拉米夫定和恩替卡韋都可產(chǎn)生耐藥的細(xì)胞系（突變位點(diǎn)：rtL180M+rtM204V+ rtT184L），由解放軍第302醫(yī)院肝衰竭中心構(gòu)建并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1藥物 ?替芬泰，純度99%，由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成，批號(hào)：20140106。

1.2.2試劑 ?DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Coring公司，批號(hào)：10-013-CVR）;胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：10099-141-500ML）;胰蛋白酶（Amresco公司，批號(hào)：Amresco-0785-1G）;EDTA（Amresco公司，批號(hào)：Amresco-177）;Trizol（美國(guó)ambion，批號(hào)：invitrogen 15596-026）;DMSO（Vetec公司，批號(hào)：V900090）;0.22 μm無(wú)菌濾器（sartorius stedim公司，批號(hào)：17575-K 25MM）。

1.2.3主要儀器 ?CCL-170B-8型二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡ESCO公司）;CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;CellBIND型細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Coring公司）;COSTAR型6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Coring公司）;sorvall lynx 4000型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）;XB4200C型電子分析天平（上海天平儀器廠）;BSC-1800IIB2型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾）;DW-86W100J型超低溫冰箱（海爾集團(tuán)）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

將采用122.5 μg（抗HBV效果較好的劑量）替芬泰的細(xì)胞作為觀察組，另設(shè)對(duì)照組，對(duì)照組除不加替芬泰外，其余處理同觀察組。

觀察組：將122.5 μg替芬泰分別加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1.0 ml/孔，每個(gè)濃度3孔，放5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。給藥第3天，更換原濃度替芬泰藥液，給藥第6天，收取細(xì)胞上清，細(xì)胞用除RNA酶的PBS溶液洗滌3次，每孔加入1 ml Trizol裂解，裂解液用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1觀察指標(biāo)

將觀察組與對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察兩組HepG2 A64細(xì)胞中，基因水平表達(dá)差異10倍、1.5倍的情況。

1.4.2觀察指標(biāo)的檢測(cè)方法

1.4.2.1細(xì)胞培養(yǎng) ?選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A64細(xì)胞，用0.02%的EDTA洗兩遍，加入0.25%胰蛋白酶1 ml，靜置消化3～5 min，輕輕吹散細(xì)胞成單個(gè)狀態(tài)，計(jì)數(shù)到2×105個(gè)細(xì)胞/ml，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1.0 ml/孔。放入5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.2基因表達(dá)的檢測(cè) ?樣品總RNA送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，利用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測(cè)RNA完整性。RNA質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，再進(jìn)一步合成用Cyanine-3-CTP（Cy3）標(biāo)記的cRNA。標(biāo)記好的cRNA和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描，得到原始圖像。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Feature Extraction軟件（version10.7.1.1，Agilent Technologies）處理原始圖像，提取原始數(shù)據(jù)。接著利用Genespring軟件（version 12.5，Agilent Technologies）進(jìn)行quantile標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，在用于比較的每組樣本中至少有一組100%標(biāo)記為Detected的探針留下進(jìn)行后續(xù)分析。利用t檢驗(yàn)的P值和倍數(shù)變化值進(jìn)行差異基因篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0且P值≤0.05。接著，對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。最后，對(duì)差異基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類(lèi)，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達(dá)模式。

2結(jié)果

2.1觀察組與對(duì)照組細(xì)胞基因表達(dá)水平的比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，觀察組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的基因表達(dá)水平比較，許多基因的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，編碼基因中表達(dá)差異10倍以上的基因有11個(gè)（表1），表達(dá)上調(diào)的基因中，免疫相關(guān)基因有白介素-21受體（IL-21R）基因。

2.2替芬泰處理HepG2 A64細(xì)胞差異表達(dá)1.5倍以上的基因

由于替芬泰抗HBV的作用較為溫和，本研究把差異表達(dá)倍數(shù)在1.5倍以上的基因全部取出，應(yīng)用KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)替芬泰處理細(xì)胞后有9個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)在1.5倍以上的胞內(nèi)小分子蛋白參與HBV感染相關(guān)分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而通過(guò)干預(yù)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)發(fā)揮體外抗HBV作用，見(jiàn)表2、圖1、圖2。

3討論

替芬泰是馬蹄金素的衍生物，其在乙肝病毒試驗(yàn)篩選的結(jié)果顯示較強(qiáng)的抗HBV活性[5]。為了深入研究替芬泰抗HBV作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了體內(nèi)外抗HBV試驗(yàn)的深入研究，結(jié)果有所發(fā)現(xiàn)。

本研究結(jié)果提示，觀察組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞比較，許多基因的表達(dá)出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，編碼基因中表達(dá)差異10倍以上的基因有11個(gè)。而梁光義[6]的研究結(jié)果也顯示，替芬泰對(duì)HepG2 A64具有抗HBV的作用。由于替芬泰抗HBV的作用較為溫和，本研究把差異表達(dá)倍數(shù)在1.5倍以上的基因全部取出，應(yīng)用KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)替芬泰處理細(xì)胞后有9個(gè)差異表達(dá)倍數(shù)在1.5倍以上的胞內(nèi)小分子蛋白參與HBV感染相關(guān)分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而通過(guò)干預(yù)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)發(fā)揮體外抗HBV作用。表達(dá)上調(diào)10倍以上的基因有5種，下調(diào)10倍以上的基因有6種。表達(dá)上調(diào)的基因中免疫相關(guān)基因有IL-21R基因。IL-21R很有可能與替芬泰的抗病毒機(jī)制有關(guān)[7]。鄭春新[8]的研究也表明，IL-21R信號(hào)通路可抑制肝癌生長(zhǎng)。近期的一項(xiàng)研究顯示，急性HBV感染患者血液中HBcAg特異的分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞比慢性HBV感染患者多，提示乙型肝炎核心抗原（HBcAg）特異的分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞對(duì)于控制HBV感染起到一定的作用[9];上調(diào)的p21分子，抑制早期細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)去調(diào)節(jié)作用使細(xì)胞增殖速率減緩;Bcl2基因編碼26KD的膜結(jié)合蛋白，可結(jié)合于線粒體外膜、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上，抑制由多種刺激信號(hào)引起的凋亡。Bcl2可能作用于Fas的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，阻止Bax插入到線粒體膜上和由Bax引起的細(xì)胞色素C的釋放。但Bcl2抑制凋亡的確切機(jī)制仍不明確[10]。Bcl2在正常肝細(xì)胞中并不表達(dá)，僅在部分肝腫瘤中可被檢測(cè)到。由于Fas在肝臟細(xì)胞中呈持續(xù)表達(dá)，故Bcl2可保護(hù)肝癌細(xì)胞，包括DNA受損的細(xì)胞逃脫Fas介導(dǎo)的凋亡。因此，Bcl2可能涉及肝癌發(fā)生的某些機(jī)制，如通過(guò)下調(diào)細(xì)胞膜上的Fas表達(dá)量來(lái)發(fā)揮其抑制凋亡的作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[11]。鈣依賴(lài)性酪氨酸激酶-2（calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase-2，Calcium-Pyk2）信號(hào)通路是目前明確可影響HBV復(fù)制的環(huán)節(jié)之一。研究證實(shí)HBx蛋白促使該信號(hào)通路中Pyk2及FAK的磷酸化，下調(diào)Src激酶通路，促進(jìn)HBV DNA的復(fù)制，但這一過(guò)程可被線粒體鈣通道阻滯劑環(huán)胞素A（Cyclosporin A，CsA）和胞漿鈣抑制劑BAPTA-AM所逆轉(zhuǎn)，并下調(diào)HBV DNA在胞內(nèi)復(fù)制及病毒抗原的分泌[12-15]。

綜上所述，經(jīng)替芬泰處理細(xì)胞基因表達(dá)水平出現(xiàn)相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，表達(dá)差異大，可由表達(dá)譜基因芯片結(jié)果推測(cè)替芬泰可通過(guò)調(diào)控HBV復(fù)制下游Calcium-Pyk2信號(hào)通路和p21因子，從而對(duì)HBx蛋白的功能產(chǎn)生影響，達(dá)到抑制HBV復(fù)制的作用;并可通過(guò)影響細(xì)胞IL-21、Bcl-2等免疫因子提高細(xì)胞抗HBV作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]張曉嵐，郭金波，尹鳳榮.2014年消化系統(tǒng)疾病臨床進(jìn)展[J].臨床薈萃，2015，30（2）：142-149，156.

[2]李言飛，張業(yè)武，王曉風(fēng)，等.2005～2017年全國(guó)法定傳染病重復(fù)報(bào)告卡大數(shù)據(jù)分析與應(yīng)用[J].疾病監(jiān)測(cè)，2019，（5）：468-472.

[3]中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝膽病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，中國(guó)民族醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝病專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，高月球.慢性乙型肝炎中醫(yī)診療指南（2018年版）[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2019，29（1）：97-102.

[4]Meng FC，Xu WR，Li YZ，et al.In silico molecular docking study of repensine and bentysrepinine against HBV DNA polymerase[J].Chin Herb Med，2015，7（1）：39-44.

[5]馮玥，霍璇，胡金芳，等.替芬泰對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體毒性[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33（9）：1248-1252.

[6]梁光義.來(lái)源于苗藥馬蹄金的化藥1.1類(lèi)新藥“替芬泰”臨床前研究[A].中國(guó)藥學(xué)會(huì).2014年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十四屆中國(guó)藥師周論文集[C].中國(guó)藥學(xué)會(huì)：中國(guó)藥學(xué)會(huì)，2014：5.

[7]樊慧蓉，慈小燕，李薇，等.抗乙肝候選新藥替芬泰的體外轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（8）：1233-1239.

[8]鄭新春.IL-21R信號(hào)通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2018.

[9]戚勝波，于奇.IL-21R、MMP-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].臨床肺科雜志，2014，19（12）：2232-2235.

[10]Pallikkuth S，Parmigiani A，Pahwa S.Role of IL-21 and IL-21 receptor on B cells in HIV infection[J].Crit Rev Immunol，2012，32（2）：173-195.

[11]王靜，李馨筱，吳琳娜，等.彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表達(dá)及意義[J].分子診斷與治療雜志，2019，11（1）：33-38.

[12]王春娥，陳可強(qiáng)，李大治，等.Pyk2、CXCR-1在COPD大鼠氣道炎癥反應(yīng)中的表達(dá)及意義[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2018，39（6）：488-492.

[13]武茜茗，寇育榮.Pyk2參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2018，35（2）：73-76.

[14]左凱，薛棟，孔麗，等.肝細(xì)胞癌中Pyk2、Twist及E-cadherin的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2017，24（4）：4-7.

[15]Verma N，Keinan O，Selitrennik M，et al.PYK2 sustains endo-somal-derived receptor signalling and enhances epithelial-to-mesenchymal transition[J].Nat Commun，2015，6（1）：6064.

（收稿日期：2019-04-04 ?本文編輯：孟慶卿）