豬丹毒桿菌的分離和鑒定

陸俊強

（相城區(qū)農業(yè)局陽澄湖動物防疫站，江蘇蘇州 215100）

豬丹毒（Swine Erysipelas，ES）也叫鉆石皮膚?。╠iamond skin disease）或紅熱?。╮ed fever），是由紅斑毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一種急性、熱性傳染病[1]。

1 材料

2019年3月常熟某養(yǎng)殖場新引進母豬10頭和育肥豬50頭，飼養(yǎng)2月左右，有4只豬不表現(xiàn)任何臨床癥狀而突然死亡，送檢病豬1例，該病豬體溫升高至41℃，精神萎糜，喜臥地，食欲時好時壞，被毛無光，貧血下痢，背上還有紅斑。剖檢后可見全身皮下脂肪及筋膜嚴重黃染，腹股溝淋巴結腫大，周邊出血，心包積液，心肌出血，肺充血、水腫，肝腫大，局部郁血，膽囊萎縮，腎皮質有較多出血點，膀胱點狀出血，腸系淋巴結腫大并周邊出血，胃底大面積出血，盲腸出血，疑似豬丹毒病例。分別對病豬的肝、脾、腎進行了采樣，作為實驗材料以備使用。

2 方法

2.1 細菌的分離

用接種環(huán)從該病豬肝、脾、腎無污染采集細菌，分別接種于血清營養(yǎng)瓊脂平板上，置37℃的恒溫箱培養(yǎng)24h。培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

2.2 細菌的純化

從血清營養(yǎng)瓊脂平板上挑取三株分離菌的單一菌落，分別接種于新的血清營養(yǎng)瓊脂平板上做純培養(yǎng)，置37℃的溫箱培養(yǎng)24h，觀察三株細菌的形態(tài)區(qū)別及生長情況。

2.3 染色鏡檢

取半玻耳的生理鹽水于一玻片上，無菌挑取純培養(yǎng)血清瓊脂平板上的可疑菌落于生理鹽水中涂布均勻（大概直徑0.5cm），自然干燥，將干燥好的抹片，涂抹面向上，以其背面在酒精燈外焰上如鐘擺樣來回拖過數(shù)次，略作加熱進行固定。做革蘭氏染色，先用結晶紫染色1min20s，水洗，用碘液媒染1min20s，水洗，用酒精脫碘25s，水洗，用復紅復染1min40s，水洗，用壓片紙壓干，油鏡鏡檢。

2.4 16SrRNA基因測序法

挑取2.2中純化的單個菌落加入10μl的16S-free H2O中，煮沸10min后，離心取上清，按照16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit（寶生生物工程（大連）有限公司）方法操作，PCR擴增出1個產物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后，用Agarose Gel DNA Extraction Kit（Roche公司）回收，回收產物由金斯瑞生物科技進行測序。

2.5 生化試驗

分別挑取純培養(yǎng)血清瓊脂平板上的菌落，接種于尿素、甘露糖、棉籽糖、果糖、乳糖、枸櫞酸鹽、甘露醇、山梨醇、麥芽糖、衛(wèi)茅醇、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、側金盞花醇、半固體瓊脂（動力）、苯丙氨酸、硝酸鹽還原、蛋白胨水（靛基質）、賴氨酸、鳥氨酸、氨對、硫化氫、葡萄糖（產氣）、葡萄糖酸鹽24種微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24～48h，分別觀察微量發(fā)酵管的顏色變化及產生氣體情況。根據(jù)結果進行細菌種屬判定[2]。

3 結果

3.1 細菌分離結果

在血清瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過37℃培養(yǎng)24h后能夠生長，長出纖細、針尖大、露珠樣、透明、表面光滑、邊緣整齊小菌落，直徑小于1mm。

3.2 鏡檢結果

分離菌涂片經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢可見紫色、細長呈直或稍彎的桿狀，以單個或短鏈存在，長約1～3μm寬約0.2～0.4μm，單在、成對或成叢排列，無運動性，無孢，革蘭氏陽性，符合豬丹毒桿菌的形態(tài)特點。

3.3 16SrRNA基因測序法結果

模板DNA后，經(jīng)PCR擴增，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80V，60min后，結果顯示檢測樣品擴增出500bp的條帶，用Agarose Gel DNA Extraction Kit（Roche公司）回收，回收產物由金斯瑞生物科技進行測序。通過因特網(wǎng)在NCBI 的Blast（http：/ / www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/）中對分離菌株測序結果進行檢索，結果為豬丹毒桿菌。

3.4 生化試驗結果

三組分離菌株的生化試驗結果基本一致，除了棉籽糖在做腎臟分離菌株時受到干擾而造成了一些偏差。分離菌株對賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照均為陰性；能夠發(fā)酵甘露糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖，不能發(fā)酵棉籽糖、阿拉伯糖、木糖；對醇類物質沒有反應；不分解尿素；不能在半固體瓊脂中生長；不還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；不產生靛基質；硫化氫反應陽性；與枸緣酸鹽、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽均不反應。

4 討論與小結

該菌株接種血清營養(yǎng)瓊脂平板37℃培養(yǎng)24h后，長出纖細、針尖大、露珠樣、透明、表面光滑、邊緣整齊小菌落，革蘭氏染色鏡檢結果為陽性短桿菌，以單個或短鏈排列，與豬丹毒桿菌的形態(tài)學特征一致，同時通過16SrRNA基因測序法結果和生化鑒定結果判定分離菌為丹毒桿菌。當下，僅僅依靠某種藥物治療豬丹毒桿菌已很困難，必須采取綜合的防制措施。因此，在治療本病時，要注意科學合理用藥，實行交替用藥和配合用藥。有條件的最好先進行藥敏試驗，篩選出高效敏感的藥物進行治療，以提高對本病的治愈率。同時夏秋天切斷其傳播途徑，加強管理，消滅吸血昆蟲，改善豬舍環(huán)境也是必不可少的