李傲然，胡倬瑜，楊 寧，孫 郡，何靜仁，何 毅*

（武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大宗糧油精深加工省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430023）

銀杏（Ginkgo biloba）又名公孫樹(shù)。其果實(shí)一般為白色，有“白果”之稱(chēng)，具有長(zhǎng)梗，外種皮肉質(zhì)，味甘略苦。銀杏果實(shí)中富含銀杏內(nèi)酯、黃酮、多酚和銀杏酸等藥用成分。DEKOSKY S T等[1]研究了銀杏在改善記憶和認(rèn)知方面的相關(guān)應(yīng)用，其還具有益氣溫肺、止喘咳，抗衰老、保護(hù)肝臟等功效[2-3]。

大麥營(yíng)養(yǎng)成分豐富、全面，含有高纖維、高維生素、低脂肪、低糖、多種微量元素以及β-葡聚糖、α-生育三烯醇、黃酮、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、抗性淀粉等多種功能成分[4]。大麥中纖維具有低血糖指數(shù)，對(duì)糖尿病患者日常生理功能維持有益[5]。AHMEDRM等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在用雙歧桿菌（Bifidobacterium）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發(fā)酵的酸奶中添加大麥β-葡聚糖可以有效降低血漿和肝臟中膽固醇的水平，同時(shí)糞便中膽汁酸的排泄增加。IDEHEN E等[7]也研究證明，大麥中富含植物化學(xué)物質(zhì)，具有與癌癥、心血管疾病、糖尿病和肥胖等常見(jiàn)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)疾病作斗爭(zhēng)的潛力。

以銀杏果為原料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品眾多，在釀酒方面，由銀杏果發(fā)酵而成的純天然有保健功能的銀杏酒也早已進(jìn)入市場(chǎng)[8]。銀杏果作為優(yōu)質(zhì)的釀酒原料，大多都是作為單一的原料用來(lái)釀酒。本研究選用銀杏和大麥為原料釀造一種口感良好、營(yíng)養(yǎng)豐富的銀杏大麥酒，采用響應(yīng)面法研究其最佳釀造工藝和釀造過(guò)程中總酸、總酚、總黃酮含量的變化規(guī)律，然后分析銀杏大麥酒的抗氧化活性。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)兼具銀杏與大麥復(fù)合香味、營(yíng)養(yǎng)豐富、保健功效的銀杏大麥酒提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏果：產(chǎn)自隨州市洛陽(yáng)鎮(zhèn)；大麥：市售；釀酒高活性干酵母：廣西丹寶利酵母有限公司；安琪高活性酵母：安琪酵母股份有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）：碧云天生物技術(shù)公司；沒(méi)食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）、硫酸亞鐵、水楊酸、酚酞、苯酚等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

STARTER3100 pH計(jì)：普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司；WIATC手持折光儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AL204型電子天平：梅特勒托利多儀器有限公司；SpectraMax M2e酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；Lambda25紫外分光光度計(jì)：美國(guó)PERKINELMER公司；7890A/5957C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Aglient公司。

1.3 方法

1.3.2 菌種的活化

稱(chēng)取適量干酵母，將其投入到10倍35～40℃蒸餾水中，復(fù)水15 min，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化2 h。

1.3.3 酵母菌的篩選

將經(jīng)處理后（大麥粉碎后與打漿好的銀杏果混合后糊化、糖化）糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調(diào)節(jié)pH至3.6，然后分別加入0.25%安琪高活性干酵母、廣西丹寶利酵母、混合酵母（安琪高活性酵母和廣西丹寶利酵按1∶1比例混合），在26℃條件下靜置發(fā)酵13 d，測(cè)定其酒精度和糖度，以確定最佳酵母菌。

1.3.4 銀杏大麥酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）發(fā)酵時(shí)間的確定

將經(jīng)處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調(diào)節(jié)pH值至3.6，然后添加0.25%高活性干酵母，在26℃發(fā)酵15 d，于第1、3、5、7、9、11、13、15天測(cè)定酒液中的酒精度和糖度。

（2）初始糖度的確定

將經(jīng)處理的銀杏大麥汁pH值調(diào)至3.6，然后添加0.25%高活性干酵母，調(diào)節(jié)銀杏大麥汁糖度分別至18°Bx、20°Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx，在26 ℃分別發(fā)酵13 d，測(cè)定各酒液的酒精度和糖度。

（3）接種量的確定

將經(jīng)處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調(diào)節(jié)pH值至3.6，然后分別添加0.10%、0.25%、0.40%、0.55%活性干酵母，在26℃發(fā)酵13 d，測(cè)定各酒液的酒精度和糖度。

（4）初始pH值的確定

將經(jīng)處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調(diào)節(jié)pH值分別至2.4、2.8、3.2、3.6、4.0，然后添加0.25%活性干酵母，在26 ℃分別發(fā)酵13 d，測(cè)定各酒液的酒精度和糖度。

（5）發(fā)酵溫度的確定

將經(jīng)處理后糖度為20°Bx銀杏大麥汁，調(diào)節(jié)pH值至3.6，然后添加0.25%高活性干酵母，分別在18℃、22℃、26℃、30℃、34℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵13 d，測(cè)定各酒液的酒精度和糖度。

1.3.5 銀杏大麥酒發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)分析結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，選擇初始糖度（A）、接種量（B）、初始pH值（C）和發(fā)酵溫度（D）這4個(gè)影響較大的因素，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以酒精度（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 大麥酒發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for ginkgo-barley wine fermentation conditions optimization

1.3.6 理化指標(biāo)的測(cè)定

pH值采用STARTER3100 pH計(jì)測(cè)定；可溶性固形物（糖度）：采用手持折光儀測(cè)定，所得數(shù)值均校正為20℃條件下的數(shù)值；總酸含量：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示劑法測(cè)定[9]；酒精度：采用分光光度計(jì)法測(cè)定[10-11]。

總黃酮含量的測(cè)定：吸取質(zhì)量濃度為0.174 561 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL的容量瓶中，分別加入5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min；加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL絡(luò)合6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%（1 mol/L）的NaOH溶液4 mL；最后用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容，搖勻，顯色20 min。在波長(zhǎng)506 nm條件下測(cè)定吸光度值，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得溶液吸光度值A(chǔ)與蘆丁質(zhì)量濃度C（mg/mL）的回歸方程：A=0.012 7C+0.093 3（R2=0.999 6）。再利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定待測(cè)液的吸光度值，然后利用回歸直線方程得出所取樣品液中的總黃酮含量[12]。

總酚含量的測(cè)定：采用Folin-Ciocalteu法[13]。精確稱(chēng)取干燥恒質(zhì)量的沒(méi)食子酸10.0 mg，溶解后加水定容到100 mL，配成0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，于10 mL刻度試管中，加5.0 mL蒸餾水，再加0.5 mL福林酚試劑，搖勻1 min后再加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，于室溫反應(yīng)2 h。在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，得溶液吸光度值A(chǔ)與沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度C（mg/mL）的回歸方程：A=9.916C+0.003（R2=0.9997）。

準(zhǔn)確量取樣品0.1 mL于10 mL刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟于760 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度值的測(cè)定（樣液如有沉淀，應(yīng)過(guò)濾后測(cè)定）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程計(jì)算總酚含量。

1.3.7 抗氧化能力測(cè)定

（1）羥基自由基清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]采用水楊酸法，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值。羥基自由基清除率按下式計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度值；A1為無(wú)水楊酸時(shí)樣品的吸光度值；A2為加入樣品后的吸光度值。

（2）DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15-16]采用DPPH·法測(cè)定清除DPPH·能力。在波長(zhǎng)517 nm下測(cè)定吸光度值。DPPH·清除率按下式計(jì)算：

式中：A0為DPPH·與無(wú)水乙醇混合液的吸光度值；A1為無(wú)水乙醇調(diào)零，加入樣品溶液后的吸光度；A2為樣品溶液與無(wú)水乙醇混合液的吸光度值。

（3）ABTS法測(cè)定總抗氧化能力

采用ABTS法測(cè)定總抗氧化能力。在波長(zhǎng)735 nm下測(cè)定各種濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值。得到并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（A=-0.778 9C+1.224 5（R2=0.999 3））計(jì)算出樣品的總抗氧化能力[17]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析進(jìn)行各試驗(yàn)組間的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的確定

表2 不同酵母對(duì)酒精發(fā)酵的影響Table 2 Effect of different yeasts on alcoholic fermentation

不同菌種對(duì)酒精發(fā)酵的影響見(jiàn)表2。在廣西丹寶利酵母發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液中酒精度最高，由此可知，廣西丹寶利酵母的發(fā)酵能力和速率優(yōu)于安琪高活性酵母和混合酵母。此外，在使用廣西丹寶利酵母發(fā)酵時(shí)，消耗了相對(duì)較少的糖分卻產(chǎn)生較高的酒精度，綜合考慮選擇廣西丹寶利酵母作為銀杏大麥酒的發(fā)酵用酵母。

2.2 銀杏大麥酒發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵影響的結(jié)果見(jiàn)圖1。發(fā)酵初期的1～7 d，發(fā)酵液中的糖含量急劇降低，同時(shí)發(fā)酵液的酒精度上升至10%vol左右，發(fā)酵至13 d時(shí)酒精度達(dá)到最大值（11.3%vol）。后續(xù)發(fā)酵銀杏大麥酒的酒精度不變，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)果酒的品質(zhì)風(fēng)味會(huì)有所影響，綜合考慮，發(fā)酵時(shí)間定為13 d。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on alcoholic fermentation

2.2.2 初始糖度對(duì)銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

初始糖度對(duì)酒精發(fā)酵影響的結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，經(jīng)同時(shí)段發(fā)酵，發(fā)酵液中酒精度隨著初始糖度的增加呈先增后減的趨勢(shì)。因?yàn)樘羌仁墙湍妇纳L(zhǎng)繁殖的“必需品”，也是其代謝合成酒精等物質(zhì)的原料。因此，隨著發(fā)酵液中初始糖度的增加，酵母菌的生長(zhǎng)和代謝速率都加快，酒精產(chǎn)生量增加，但糖度過(guò)高則會(huì)抑制酵母菌生長(zhǎng)繁殖和代謝。綜合考慮，確定22°Bx為銀杏大麥酒發(fā)酵的最佳初始糖度。

圖2 初始糖度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of initial sugar content on alcoholic fermentation

2.2.3 酵母菌接種量對(duì)銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

接種量對(duì)酒精發(fā)酵影響的結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中糖度持續(xù)降低，酒精度呈先增后減趨勢(shì)。結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，釀酒酵母接種量適當(dāng)增加有利于發(fā)酵過(guò)程的快速啟動(dòng)和代謝產(chǎn)物生成，有利于酒精的生成，減少污染雜菌的機(jī)會(huì)[18]。綜合考慮，確定0.25%為銀杏大麥酒發(fā)酵的最佳酵母菌接種量。

圖3 接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of inoculum on alcoholic fermentation

2.2.4 初始pH值對(duì)銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

由圖4可知，從pH值2.4開(kāi)始，隨著發(fā)酵液初始pH值逐漸增大，銀杏大麥酒的酒精度呈先增后減趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值為3.6時(shí)，酒體中酒精度達(dá)到最高。出現(xiàn)變化主要原因是酵母有適合其生長(zhǎng)、繁殖和代謝的pH范圍。當(dāng)pH過(guò)低或過(guò)高時(shí)，酵母的生長(zhǎng)和繁殖受到抑制，代謝活性降低，產(chǎn)生的酒精量減少。因此，確定pH值3.6為銀杏大麥酒釀造的最佳初始pH值。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on alcoholic fermentation

2.3 銀杏大麥酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

將初始糖度、接種量、初始pH值和發(fā)酵溫度作為評(píng)價(jià)因素，以銀杏大麥酒的酒精度（Y）為響應(yīng)值，共設(shè)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，銀杏大麥酒的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。利用Design-Expert軟件對(duì)表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到酒精度（Y）對(duì)自變量A（初始糖度）、B（接種量）、C（初始pH值）、D（發(fā)酵溫度）的回歸方程[18]：

圖4 初始pH值對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial p H value on alcoholic fermentation

2.2.5 發(fā)酵溫度對(duì)銀杏大麥酒酒精度和糖度的影響

由圖5可知，發(fā)酵溫度從18℃升高到34℃時(shí)，發(fā)酵液中酒精度含量呈先增后減趨勢(shì)。26℃時(shí)發(fā)酵液中酒精度最高、糖度最低。主要原因是溫度影響酵母菌的生長(zhǎng)，隨著溫度升高，酵母對(duì)糖的消耗以及代謝產(chǎn)生酒精的速率加快。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，酵母老化加快，導(dǎo)致產(chǎn)生的酒精量減少，容易造成雜菌污染，嚴(yán)重影響銀杏大麥酒的風(fēng)味和口感。因此，選擇26℃作為銀杏大麥酒的最佳發(fā)酵溫度。

表3 大麥酒發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for ginkgo-barley wine fermentation conditions optimization

續(xù)表

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

銀杏大麥酒酒精度對(duì)初始糖度、接種量、初始pH值和發(fā)酵溫度4因素回歸模型的響應(yīng)曲面和等高線如圖6所示。在交互作用對(duì)銀杏大麥酒的酒精度影響中，初始糖度與初始pH值的交互作用最顯著（P＜0.01），其次是接種量與初始pH值的交互作用顯著（P＜0.05），而初始糖度與接種量、初始糖度與發(fā)酵溫度、接種量與發(fā)酵溫度和初始pH值與發(fā)酵溫度的交互作用不顯著（P＞0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

2.3.2 回歸模型的方差分析

對(duì)銀杏大麥酒發(fā)酵條件的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，以檢驗(yàn)方程的有效性和各因子的偏回歸系數(shù)，回歸模型的方差分析如表4所示。由表4可知，該試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.01），方差的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.074 0＞0.05），即模型選擇合適；同時(shí)，所選模型的校正決定系數(shù)R2=0.941 7，表明此模型能解釋94.17%的結(jié)果值變化，僅有總變異5.83%不能用該模型解釋?zhuān)究捎糜阢y杏大麥酒發(fā)酵條件的分析和預(yù)測(cè)。在此試驗(yàn)設(shè)計(jì)的作用因素中，一次項(xiàng)A（初始糖度）、C（初始pH值）、D（發(fā)酵溫度）、二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2及交互項(xiàng)AC對(duì)銀杏大麥酒酒精度的影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)銀杏大麥酒酒精度的影響顯著（P＜0.05），B（接種量）及交互項(xiàng)AB、AD、BD、CD對(duì)銀杏大麥酒酒精度的影響均不顯著（P＞0.05）。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

圖6 初始p H值、初始糖度以及接種量的交互作用對(duì)銀杏大麥酒酒精度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour line of effects of interaction between initial pH value,sugar content and inoculum on the alcohol content of ginkgo-barley wine

2.3.4 最佳發(fā)酵條件的確定

根據(jù)Box-Behnken Design試驗(yàn)分析的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 8.0.6.1軟件，可獲得銀杏大麥酒的最佳發(fā)酵條件，即初始糖度22.80°Bx、接種量0.24%、初始pH值3.70、發(fā)酵溫度27.0℃。在此最優(yōu)條件下，銀杏大麥酒的酒精度最高，為11.51%vol。為驗(yàn)證此模型的可靠性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，所得銀杏大麥酒的平均酒精度為11.46%vol；與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為0.43%，說(shuō)明模型可以較好地反映出銀杏大麥酒的發(fā)酵條件，也再次證明了通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)銀杏大麥酒的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化如圖7所示，銀杏大麥酒的總酸含量在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先顯著上升后緩慢下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵第3天時(shí)達(dá)到最高，為121 mg/100 mL。原因是酵母菌在發(fā)酵前3 d的發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)形成少量的有機(jī)酸，如乙酸、月桂酸、檸檬酸和酒石酸等[20]，使酒液的總酸呈顯著上升趨勢(shì)。在發(fā)酵后期，總酸含量在保持穩(wěn)定的基礎(chǔ)上略有下降，保持在80～100 mg/100 mL，是因?yàn)槎趸季徛绯觯瑫r(shí)部分酸性物質(zhì)轉(zhuǎn)化成了酯、醛、酮等其他物質(zhì)，使總酸含量緩慢下降。

圖7 發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Fig.7 Changes of total acid content during the fermentation

2.5 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化如圖8所示，銀杏大麥酒中的總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降，最后小幅升降的趨勢(shì)。發(fā)酵前期由于出汁量較多或者產(chǎn)生的乙醇有利于酚類(lèi)物質(zhì)的溶出，使過(guò)久的總酚含量增加，并在發(fā)酵第2天時(shí)達(dá)到最高，為0.34 mg/mL。隨著氧化時(shí)間延長(zhǎng)，隨著酵母菌和銀杏果和大麥原始菌群的生長(zhǎng)繁殖，微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶會(huì)使多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生降解，使得總酚含量呈下降趨勢(shì)。7～13 d，總酚含量呈小幅升降的趨勢(shì)，這可能是由于之前未溶出的酚類(lèi)物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的推移慢慢溶出及后續(xù)慢慢被氧化造成的[21-22]。

圖8 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig.8 Changes of total phenols content during the fermentation

2.6 發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化如圖9所示，在銀杏大麥酒的前酵階段，發(fā)酵時(shí)間不超過(guò)2 d時(shí)，黃酮含量下降速度較快，而在銀杏大麥酒的后酵階段，發(fā)酵7 d后，銀杏大麥酒中黃酮含量下降較緩慢，并趨于平穩(wěn)?？傸S酮的含量呈下降趨勢(shì)，是由于黃酮難溶于水而較易溶于乙醇溶液，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行將有越來(lái)越多的黃酮遷移至酒體中。從而銀杏大麥酒和大麥銀杏酒中的黃酮的含量明顯下降。

圖9 發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化Fig.9 Changes of total flavonoids content during the fermentation

2.7 抗氧化性的變化

2.7.1 羥基自由基清除能力的測(cè)定

由圖10所示，羥基自由基的清除率緩慢上升，最終數(shù)值穩(wěn)定在98%左右。是由于銀杏大麥酒中功能性成分如總酚、多糖等含量較高，這些功能性成分對(duì)·OH具有較好的清除能力。

圖10 不同發(fā)酵時(shí)間大麥酒的羥基自由基清除率Fig.10 Hydroxyl radical scavenging rate of ginkgo-barley wine with different fermentation time

2.7.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

如圖11所示，銀杏大麥酒對(duì)DPPH自由基清除率呈先升后降，之后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，最后測(cè)量值穩(wěn)定在37%左右。發(fā)酵前期與總酚的變化基本一致，在發(fā)酵前期抗氧化能力提高是由于酚類(lèi)化合物含量增加引起的，之后的下降是由于酚類(lèi)物質(zhì)被氧化或被酶解造成的，也可能因?yàn)辄S酮的不穩(wěn)定性及發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶分解了酚類(lèi)等大分子物質(zhì)，導(dǎo)致抗氧化性降低。

圖11 不同發(fā)酵時(shí)間大麥酒的DPPH自由基清除率Fig.11 DPPH radical scavenging rate of ginkgo-barley wine with different fermentation time

2.7.3 總抗氧化能力測(cè)定

如圖12所示，總抗氧化性能力總體呈先升后降，之后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，總抗氧化能力的變化可能與發(fā)酵過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)解離和聚合等復(fù)雜反應(yīng)以及銀杏果實(shí)中游離酚和結(jié)合酚的含量有關(guān)[23]。由圖8和圖12可知，銀杏大麥酒中總酚含量與總抗氧化能力的變化基本一致。

圖12 不同發(fā)酵時(shí)間大麥酒的總抗氧化能力變化Fig.12 Total antioxidant capacity changes of ginkgo-barley wine with different fermentation time

3 結(jié)論

以銀杏果和大麥為原料，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)銀杏大麥酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件：初始糖度22.80°Bx、接種量0.24%、初始pH值3.70、發(fā)酵溫度27.0℃。在該工藝下釀造的銀杏大麥酒的酒精含量在11.4%vol左右，屬于低酒精度飲料酒。銀杏大麥酒經(jīng)發(fā)酵后總酸含量維持在80～100 mg/100 mL，總酚含量保持在0.3 mg/mL左右，其羥基自由基清除率穩(wěn)定在98%左右，DPPH自由基清除率穩(wěn)定在37%左右，總抗氧化性能力指標(biāo)保持在較高的水平。但釀造過(guò)程中酒體中黃酮類(lèi)物質(zhì)會(huì)有一定程度的損失，因此還需要對(duì)釀造工藝進(jìn)行改進(jìn)，以最大程度的保留黃酮類(lèi)物質(zhì)，以進(jìn)一步增強(qiáng)其保健功能。