種 堔， 董美希， 劉 瑩， 范國兵， 張敏娜， 王光輝， 吳景龍

帕金森病(parkinson’s disease，PD)為ROS氧化應(yīng)激損傷和炎癥因子的釋放等選擇性的造成中腦部位多巴胺能神經(jīng)元變性喪失的一種神經(jīng)退行性疾病。臨床治療常用左旋多巴、苯海索等藥物，不良反應(yīng)較重且需長期服藥。利用干細(xì)胞增殖、定向分化和趨化性遷移等生物學(xué)屬性[1～3]，有望分化形成多巴胺能神經(jīng)元，取代帕金森病等神經(jīng)退行性疾病變性、壞死的神經(jīng)元。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤來源的未分化型PC12細(xì)胞等神經(jīng)元前體細(xì)胞都具備多巴胺能神經(jīng)元分化潛能[4～8]，分化為成體細(xì)胞參與替代和修復(fù)受損的神經(jīng)組織。誘導(dǎo)分子及其信號通路對分化細(xì)胞的表型作用是探索以上各類干細(xì)胞分化機(jī)制的關(guān)鍵，目前這方面報(bào)道較少。本研究通過IL-1β對大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neutral stem cells，NSCs)誘導(dǎo)分化，探尋蛋白激酶B/Akt信號通路磷酸化與NSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元表型的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、主要儀器和圖像分析軟件 新生24 h Wistar大鼠培養(yǎng)自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物處置符合相關(guān)倫理學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號SYXK(魯)20180002。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)和B27神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑、青霉素及鏈霉素(Gibco 公司，美國)，胎牛血清FBS(四季青公司，杭州)、EGF、IL-1β和bFGF(Peproetch 公司，美國)，多聚賴氨酸和胰蛋白酶、TH(tyrosine hydroxylase) 抗體(Sigma 公司，美國)，βⅢ-Tubulin(human) mAb(TU-20)來自Alexis公司，anti-phospho-Akt抗體、NSE Antibody(PA1-21081)、GFAP抗體、大鼠來源的nestin抗體來自Cruz Biotechnology公司，圖像分析軟件Motic Digital Class 1.1 /Motic Images Advanced 3.1來自美國Motic公司、解剖顯微鏡、IX71相差顯微鏡來自O(shè)lympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NSCs原代培養(yǎng) 清潔級24 h新生幼鼠斷頸法處死后消毒15 min。無菌操作沿顱骨縫剪開 “人”字形切口，取腦組織約5 mm×5 mm×5 mm大小(中腦腹側(cè)部位)，D-Hanks 液浸洗后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷D-Hanks 液內(nèi)，分離腦膜，充分游離腦膜附著血管。D-Hanks 液再次浸洗3～5次。胰酶經(jīng)5%CO237 ℃恒溫條件下消化15 min，輕柔吹打300次，400目濾網(wǎng)濾過后收集濾液離心鏡下計(jì)數(shù)后接種至無血清細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、B27添加物、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、青霉素鏈霉素培養(yǎng)液內(nèi)，接種密度1×105個(gè)/ml，培養(yǎng)條件為37 ℃ 5%CO295%飽和濕度恒溫培養(yǎng)。每3～4 d換液1次，每7 d計(jì)數(shù)傳代1次。

1.2.2 NSCs生物學(xué)屬性鑒定 nestin蛋白檢測：細(xì)胞離心機(jī)涂片后4%多聚甲醛固定30 min，行細(xì)胞免疫熒光檢測。nestin抗體工作液濃度為1∶800，封片后在熒光顯微鏡下觀察和拍照。分化能力檢測：1×105/ml接種至無血清細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、B27添加物，特別加入10% FBS，分化7 d后行4%多聚甲醛固定30 min，細(xì)胞免學(xué)檢測GFAP和NSE。

1.2.3 IL-β誘導(dǎo)NSCs分化與免疫學(xué)檢測 取第3代培養(yǎng)細(xì)胞以1×105/ml密度接種48孔板內(nèi)，每孔1 ml。設(shè)立10%FBS對照組，實(shí)驗(yàn)組分別為A組IL-1β 40 pg/ml、B組80 pg/ml、C組120 pg/ml和D組160 pg/ml。至3.5 d半量換液，分化7 d后中止誘導(dǎo)，重復(fù)3組。分化7 d后中止誘導(dǎo)后免疫熒光檢測，隨機(jī)取6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)βⅢ-tubulin和TH表達(dá)。陽性率計(jì)算方法為細(xì)胞陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值記錄。圖像分析軟件Motic Digital Class 1.1 /Motic Images Advanced 3.1測量多巴胺能神經(jīng)元突起，隨機(jī)記錄熒光顯微鏡高倍鏡視野突起總長度數(shù)值。

1.2.4 免疫印跡分析 濃度設(shè)置為120 pg/ml IL-β誘導(dǎo)NSCs 60 min、120 min、180 min和240 min。10%FBS誘導(dǎo)組為對照。終止誘導(dǎo)后，裂解液RIP 1 ml和PMSF10 μl分解分化細(xì)胞，超聲粉碎離心取上清液，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃10 min后，取10 g加載到10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，電泳分離結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，時(shí)間90 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，加入山羊抗鼠二抗與辣根過氧化物酶室溫下孵育，2 h后加入抗磷酸化Akt抗體(1∶20000)，條件為4 ℃過夜，隔日取出，室溫放置60 min，TBST沖洗膜3次，ECL暗室曝光，軟件掃碼條帶灰度。β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算磷酸化的蛋白激酶B/Akt表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs培養(yǎng)和鑒定 原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)24 h形成神經(jīng)球群落，如圖1A所示，每個(gè)神經(jīng)球約有30～60個(gè)橢圓形或圓形分化細(xì)胞聚集形成；制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行免疫熒光染色，nestin蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，如圖1D所示胞漿呈鮮紅熒光者即為陽性細(xì)胞；血清分化后如圖1B所示，細(xì)胞發(fā)出2～5個(gè)突起，隨時(shí)間增加，長度延長，末端見樹突棘；誘導(dǎo)72 h如圖1C所示突起之間連接成網(wǎng)狀。細(xì)胞鋪片免疫學(xué)檢測如圖1E和1F所示，NSE和GFAP在分化細(xì)胞中表達(dá)。

2.2 IL-1β誘導(dǎo)NSCs分化 設(shè)置10%FBS 為對照組、實(shí)驗(yàn)組分A組IL-1β 40 pg/ml、B組IL-1β 80pg/ml、C組IL-1β 120 pg/ml和D組IL-1β 160 pg/ml，誘導(dǎo)14 d后檢測β-tubulinⅢ表達(dá)、TH的表達(dá)和神經(jīng)突起長度，結(jié)果(見表1)。

2.3 IL-1β對NSCs分化過程Akt磷酸化的影響 設(shè)置IL-1β 120 pg/ml為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞，10%FBS為對照組。實(shí)驗(yàn)各組分別取60 min、120 min、180 min和240 min 四個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間段，Western blot分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)各組與10%FBS對照組比較，Akt磷酸化水平升高的時(shí)間為誘導(dǎo)60 min(P<0.01)、120 min(P<0.01)和180 min(P<0.05)，誘導(dǎo)240 min時(shí)AKT磷酸化水平二者相比差異不明顯(P>0.05)(見圖2)。

A：細(xì)胞克隆增殖聚集形成神經(jīng)球(×400)；B：10%FBS 24 h神經(jīng)突起開始出現(xiàn)(×100)；C：10%FBS 72 h神經(jīng)突起延長并且相互連接形成突觸狀結(jié)構(gòu)(×100)D：免疫熒光顯示神經(jīng)球細(xì)胞Nestin表達(dá)(SP×400)；E：免疫細(xì)胞化學(xué)顯示分化細(xì)胞NSE表達(dá)(SP×400)；F：免疫細(xì)胞化學(xué)顯示分化細(xì)胞GFAP表達(dá)(SP×400)

IL-1β120 pg/ml誘導(dǎo)NSCs后分化細(xì)胞半定量分析磷酸化Akt表達(dá)結(jié)果，與10%FBS對照組比較P<0.01(60 min)，P<0.01(120 min)，P<0.05(180 min)，P>0.05(240 min)

表1 NSCs誘導(dǎo)分化結(jié)果

3 討 論

從神經(jīng)系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)中腦多巴胺能經(jīng)元神經(jīng)元的分化過程涉及多種信號通道及細(xì)胞外信號分子、調(diào)控蛋白分子以及相關(guān)基因。Shabana[9]和Vukasin等[10]研究發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白BMP/SMADs途徑激活后的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)MSX1/2基因和SHH基因的表達(dá)，使多巴胺能神經(jīng)元的分化表型明顯增加。另據(jù)研究顯示大腦發(fā)育形成過程中，來源于不同部位的神經(jīng)前體細(xì)胞基因表型有所差異，GABA能神經(jīng)元主要表達(dá)在前腦部位，而中腦是以多巴胺能神經(jīng)元明顯占優(yōu)勢，這種調(diào)控可能與鋅蛋白ZINC1和ZINC2參與分化平衡調(diào)控相關(guān)[11]。Varshneyd等[12]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體β(ER-β)誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞發(fā)育為多巴胺能神經(jīng)元過程中通過Notch信號的激活發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其研究結(jié)果表明激素及其受體參與了神經(jīng)元的遷移和分化表型調(diào)控。各種細(xì)胞外信號分子的誘導(dǎo)下，尤其在低氧環(huán)境下，多巴胺能神經(jīng)元表型分化相關(guān)編碼基因被激活，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)、白細(xì)胞介素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neuotrophic factors，BDNF)為NSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元提供體外分化信號[13～15]。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞原代取材于幼鼠中腦部位，通過神經(jīng)球懸浮法培養(yǎng)和及時(shí)傳代獲得有效的增殖細(xì)胞群落。中腦神經(jīng)元分化過程中借助鋅蛋白ZINC1和ZINC2等參與表型分化平衡調(diào)控，保證了多巴胺能神經(jīng)元基因表型的優(yōu)勢。IL-1β作為信號分子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)以及酪氨酸羥化酶TH分化細(xì)胞(多巴胺能神經(jīng)元)表達(dá)增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)巴胺能神經(jīng)元突起的長度隨著IL-1β濃度增加而上增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-1β是NSCs向多巴胺能神經(jīng)元表型分化過程中關(guān)鍵的細(xì)胞外信號分子。

Akt作為一種靶蛋白(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)位于PI3K(磷酸肌醇3激酶)下游，構(gòu)成PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵部分，包含氨基PH 結(jié)構(gòu)域(位于末端)、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(位于碳末端)和催化結(jié)構(gòu)域(中心位置，絲氨酸/蘇氨酸)三部分。Akt根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的差異分為Akt1、Akt2和Akt3 3種不同功能亞型，Akt1控制細(xì)胞增殖，Akt2與細(xì)胞遷移相關(guān)，Akt3決定細(xì)胞分化表型。Akt經(jīng)磷酸化修飾后被激活后，繼而呈現(xiàn)瀑布式激活下游級聯(lián)信號系統(tǒng)以及多個(gè)靶分子位點(diǎn)，主要包括核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、caspase以及促凋亡蛋白Bad等，增強(qiáng)細(xì)胞代謝、促進(jìn)增殖發(fā)育、抑制細(xì)胞凋亡程序的激活等生理作用[16～18]。研究表明缺氧條件下、BDNF腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等細(xì)胞因子通過磷酸化激活PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)了NSCs自我復(fù)制增殖和神經(jīng)元方向的定向分化[19，20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中IL-1β誘導(dǎo)后Akt 的磷酸化水平顯著升高，尤其是誘導(dǎo)后60 min 和120 min 磷酸化水平明顯升高，過后隨著時(shí)間延長表達(dá)水平降低。本研究提示Akt 磷酸化修飾可能參與細(xì)胞外信號分子IL-1β對NSCs分化調(diào)節(jié)過程，通過上調(diào)磷酸化Akt的表達(dá)促進(jìn)NSCs向多巴胺能神經(jīng)元表型轉(zhuǎn)化。