張玉潔， 陸 潔， 孟新玲， 許奔奔， 徐 夢， 張 燕

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以進(jìn)行性記憶及認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，占所有癡呆患者的60%～80%[1，2]。眾所周知，遺傳因素及環(huán)境因素均參與了AD的發(fā)病，不同種族及不同地區(qū)人群AD的發(fā)生率不同，本課題組前期對新疆阿勒泰地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)研發(fā)現(xiàn)該地區(qū)55歲以上哈薩克族居民AD患病率明顯高于當(dāng)?shù)貪h族AD患病率，且高于全國水平，其患病率隨著年齡急劇增長，尤其是80歲以上人群AD患病率高達(dá)30.28%[3]。

近年全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome wide association studies，GWAS)發(fā)現(xiàn)了很多新的晚發(fā)型AD(1ateonset Alzheimefs disease，LOAD)可能的風(fēng)險基因，亦發(fā)現(xiàn)聚集素(clusterin，CLU)中CLU基因的多態(tài)性與AD風(fēng)險相關(guān)[4，5]。CLU作為細(xì)胞外伴侶，與Aβ1-40寡聚體相互作用，并能夠通過封存影響其聚集和分解，研究CLU基因多態(tài)性，可能掌握重要的線索來闡明與AD發(fā)病的有關(guān)的機(jī)制。不同種族進(jìn)行了多項驗證研究，目前其研究結(jié)果并不一致。新疆哈薩克族是游牧民族，有自身特殊的地域環(huán)境因素、生活方式和民族習(xí)俗，遺傳背景有差異性。目前有關(guān)新疆哈薩克族AD基因方面研究較少，本研究采用病例對照方法探討CLU基因rs11136000 位點及rs9331888位點多態(tài)性與新疆哈薩克族SAD的相關(guān)性。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 收集來自全疆各地2016年1月～2018年2月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)退行性疾病臨床大數(shù)據(jù)庫的AD患者共118例，均為散發(fā)性；其中哈薩克族58例，漢族60例，男性75例，女性43例，年齡在49～91歲之間，平均(74.6±7.85)歲，選擇與病例組相匹配的年齡、性別、地域環(huán)境因素、生活方式和民族習(xí)俗，并無血緣關(guān)系的非AD患者或健康志愿者作為對照組，共139例，其中哈薩克族79例，漢族60例，男性75例，女性64例，年齡在58～81歲之間，平均(72.7±6.21)歲。所有被研究對象均需在知情同意書上簽字。按照新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會制定的倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行審核。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均主要表現(xiàn)記憶力障礙，癥狀持續(xù)時間≥6 m，癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國精神病學(xué)會制定的DSM-IV。經(jīng)全套神經(jīng)精神量表進(jìn)行癡呆篩查，且符合2011年美國國家衰老研究所和阿爾茨海默病學(xué)會(NIA-AA)標(biāo)準(zhǔn)制定的“很可能AD癡呆”的核心臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)改良HACHINSDI缺血評分(Hachinski ikschemic sacle，HIS)<4分，MRI排除血管性癡呆(VD)和其他可導(dǎo)致癡呆的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。(3)漢密爾頓抑郁量表(HAMD)24項版評分<17分，排除抑郁癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：由創(chuàng)傷、中毒、腫瘤、甲狀腺功能減退癥、維生素缺乏癥、帕金森病、血管性癡呆及其他腦器質(zhì)性疾病引起的各種癡呆。所有患者的確診由兩名神經(jīng)內(nèi)科副主任醫(yī)師獨立完成，所有的研究對象在納入前均簽署知情同意書，本研究通過新疆自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 收集空腹靜脈血5 ml并置于-80 ℃冰箱中，分批進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2 KASP技術(shù)及DNA測序檢測CLU基因位點多態(tài)性 研究中的SNP基因座信息來自公共數(shù)據(jù)庫NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫，查詢基因CLU標(biāo)準(zhǔn)序列(httP// www. ncbi. nlm. nih. Gov/ Gene bank/GenebankOveriew. hlm)。其序列號為rs11136000 及rs9331888位點。采用Primer Premier 3.o軟件設(shè)計SNPrs11136000 及rs9331888位點的KASP引物httP：//bioinfo. ut. ee/Primer3-0.4.0/httP：//bioinfo. ut. ee/Primer3-0.4.0/)，rs11136000位點Primer_Allele FAM引物序列為5’-CTCAAACTCCTGACCCCAAG-3’，Primer_Allele HEX引物序列為5’-CTATTGCAACCATGCCTCCT-3’。rs9331888位點Primer_Allele HEX引物序列為5’-ATGCAACAGCCTCAGCTTCT-3’，Primer_Allele HEX引物序列為5’-AGGCTTCCCAGAGAAAGTCC-3’。PCR產(chǎn)物用LGC公司的KASP Master Mix V3.0進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序結(jié)束后將樣本置于ABI Q6中檢測FAM及HEX熒光信號，收集熒光信號，儀器根據(jù)每個樣本檢測的熒光信號值自動分型Homozygous為純合子，Heterozygous為雜合子。隨機(jī)挑選樣本進(jìn)行直接測序驗證KASP分型結(jié)果，將大小正確的PCR產(chǎn)物切膠回收后送新疆昆泰瑞生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗，采用基因計數(shù)法描述SAD及對照組基因頻率和基因型分布；其計數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示，SAD及對照組之間比較采用χ2檢驗和Firsher精確概率法，計算優(yōu)勢比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)表示相對風(fēng)險；數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0進(jìn)行處理。借助HaPloview 4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡(1inkage disequilibrium，LD)分析和單體型(haPlotyPe)分析。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，檢驗水準(zhǔn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 本研究對AD組和對照組的性別、年齡、吸煙史等相關(guān)影響因素等進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩組一般資料之間均無明顯差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

2.2 Hardy-weinberg平衡定律吻合度檢驗 漢族及哈薩克族病例組與及對照組CLU基因rs11136000、rs9331888基因型分布均符合Hard-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，吻合度良好。

2.3 基因多態(tài)位點檢測結(jié)果 電泳圖、測序圖、KASP分型圖結(jié)果：CLU基因rs11136000、rs9331888位點，為檢測基因濃度及純度，電泳結(jié)果見圖1、3，經(jīng)測序峰圖分析見圖2、4，KASP分型(見圖5、圖6)。

2.4 漢、哈SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系

2.4.1 新疆SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系 整體SAD組CLU基因rs11136000 多態(tài)位點T等位基因頻率明顯低于對照組(15.7% VS 25.2%，χ2=6.991，P=0.008)，攜帶T等位基因患AD風(fēng)險比攜帶G等位基因者低44.8%(OR=0.552，95%CI=0.355～0.762，P=0.008)，SAD組TT基因型頻率也明顯低于對照組(1.7% VS 7.9%，χ2=7.991，P=0.018)，SAD組攜帶TT基因型頻率患AD風(fēng)險比攜帶GG基因型者低82.5%(OR=0.175，95%CI=0.349～0.961，P=0.034)，TG基因型患AD風(fēng)險比攜帶GG基因型者低33.7%(OR=0.663，95%CI=0.190～0.899，P=0.024)，Logistic校正年齡、性別的影響后，發(fā)現(xiàn)攜帶T等位基因者(TT+TG基因型)患AD風(fēng)險比攜帶GG基因型者低42.8%(OR=0.572，95%CI=0.349～0.961，P=0.034)(見表2)。

2.4.2 哈族SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系 新疆哈族SAD組CLU基因rs11136000 多態(tài)位點T等位基因頻率明顯低于對照組(12.9% VS 27.8%，χ2=8.809，P=0.003)，SAD組TT基因型頻率也明顯低于對照組(1.7% VS 8.9%，χ2=8.242，P=0.016)，Logistic校正年齡、性別的影響后，發(fā)現(xiàn)攜帶T等位基因者(TT+TG基因型)患AD風(fēng)險比攜帶GG基因型者低63.9%(OR=0.361，95%CI=0.171～0.762，P=0.007)，TG基因型患AD風(fēng)險比攜帶GG基因型者低58.6%(OR=0.414，95%CI=0.190～0.899，P=0.024)(見表3)。

2.4.3 漢族SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD

的關(guān)系 SAD與對照組CLU rs11136000 位點等位基因(T、G)及基因型(TT、TG、GG)頻率(T：18.3% vs 21.7%，G：81.7% vs 78.3%，TT：1.7% vs 6.7% TG：33.3% vs 30.0%，GG：65.0% vs 63.3%)比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.417，P=0.51，χ2=1.782，P=0.516)(見表4)。

2.4.4 漢族SAD組及對照組CLU基因rs11136000 位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系 SAD與對照組CLU rs11136000 位點等位基因(T、G)及基因型(TT、TG、GG)頻率(T：18.3% vs 12.9%，G：81.7% vs 87.1%，TT：1.7% vs 1.7%，GG：65.0% vs 75.9%，TG：33.3% vs 22.4%)比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.302，P=0.254；χ2=1.753，P=0.416)(見表5)。

2.5 CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系

2.5.1 新疆SAD組及對照組CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系 SAD與對照組CLU rs9331888 位點等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)頻率比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(見表6)。

2.5.2 新疆哈族CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系 SAD與對照組CLU rs9331888 位點等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)頻率比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(見表7)。

2.5.3 新疆漢族CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布與AD的關(guān)系 SAD與對照組CLU rs9331888 位點等位基因(C、G)及基因型(CC、CG、GG)頻率比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2 =1.068，P=0.301；χ2=1.111，P=0.574)(見表8)。

2.6 rs11136000及rs9331888位點單體型分析檢測及與AD 危險度的關(guān)聯(lián)分析 運用HaPloview4.2軟件進(jìn)行單體型分析，顯示rs11136000及rs9331888位點進(jìn)行連鎖不平衡及單體型分析，結(jié)果顯示rs11136000及rs9331888位點存在連鎖平衡(D’=0.764)，研究對象中單體型分析顯示有C-C、C-G、T-G3種單體型，果顯示3種單體型頻率在人群中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LD圖(見圖7)。單倍型分布(見表9)。

表1 AD組與對照組一般臨床資料比較

表2 CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表3 哈族CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表4 漢族CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表5 漢族與哈族AD CLU基因rs11136000位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表6 整體CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表7 哈族CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表8 漢族 CLU基因rs9331888位點等位基因和基因型頻率分布例數(shù)(%)

表9 CLU基因在正常組與AD組之間單倍型分布頻率

圖1 rs11136000位點電泳結(jié)果

圖2 rs11136000位點測序結(jié)果

圖3 rs931888位點電泳結(jié)果

圖4 rs931888位點測序結(jié)果

圖5 rs11136000KASP分型圖片

圖6 rs9331888KASP分型圖片

圖7 GLU基因rs11136000及rs9331888位點SNPs連鎖關(guān)系LD圖

3 討 論

CLU基因在笫八號染色體上，也被稱作載脂蛋白J(APoJ)基因，編碼凝聚素，位于染色體8P21-P12上，與APOE有一定相關(guān)性，是分布在外周循環(huán)系統(tǒng)和大腦中的一種多功能脂蛋白，參與脂質(zhì)運輸，同時也參與Aβ的清除、細(xì)胞凋亡、膜循環(huán)、炎癥反應(yīng)[6]。研究表明，CLU多態(tài)性可以通過改變Aβ積聚來調(diào)節(jié)AD易感性，且CLU變體可能通過其對Aβ沉積發(fā)揮作用和影響海馬萎縮[7]。研究表明載脂蛋白J血漿濃度與AD患者嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展速度以及內(nèi)嗅皮質(zhì)和海馬萎縮有關(guān)[8，9]。AD的前驅(qū)期，MCI患者血漿載脂蛋白J水平升高也與較低的腦萎縮發(fā)生率有關(guān)，這種萎縮涉及海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)，即在早期階段影響大腦區(qū)域AD發(fā)病機(jī)制，結(jié)果表明聚集蛋白水平在AD前驅(qū)階段已開始以選擇性的方式沿AD發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)。這種保護(hù)性血漿反應(yīng)可能至少部分地調(diào)節(jié)MCI向AD癡呆的進(jìn)展[7]。2009年兩個大型GWAS首次報道CLU與LOAD顯著有關(guān)[4，5]，由此推測CLU基因與AD發(fā)病密切相關(guān)，可能掌握重要的線索來闡明與AD發(fā)病有關(guān)的機(jī)制。

我們首次分析了新疆哈薩克族人群CLU基因rs11136000 位點與AD的相關(guān)性。結(jié)果顯示CLU基因rs11136000 位點與AD風(fēng)險相關(guān)，TT基因型和T等位基因(OR=0.361，95%CI=0.171～0.762，P=0.007)可能降低新疆哈薩克族人群AD的發(fā)病風(fēng)險。有研究表明rs11136000等位基因T可延緩在MCI到AD進(jìn)程[7]，有趣的是其他研究表明，與非攜帶rs11136000的G等位基因相比，在攜帶rs11136000的G等位基因的認(rèn)知正常的個體中更容易發(fā)展成MCI或AD，且在記憶固有區(qū)域大腦局部腦血流量明顯增加[10]。在一項針對哥倫比亞人群研究[11]發(fā)現(xiàn)CLU基因rs11136000位點最小等位基因T能降低AD風(fēng)險(OR= 0.66，P= 0.028)，其結(jié)果受年齡、血統(tǒng)、APoEε4狀態(tài)的影響。我們研究結(jié)果同SeshadriS等[12]在歐洲人群研究一致。然而一項關(guān)于巴西人群[13](70%高加索人及30%非高加索人)及印度人群[14]的研究未發(fā)現(xiàn)CLU基因rs11136000位點多態(tài)性與AD相關(guān)。Wang等[15]研究顯示中國漢族CLU rs11136000多態(tài)性與AD風(fēng)險相關(guān)。同樣，Lu的研究結(jié)果表明CLU rs11136000多態(tài)性可能不是AD易感性影響南方漢族人群的因素[16]?？傊瓹LU基因rslll36000在不同人群及種族研究結(jié)果并不一致。

本研究未發(fā)現(xiàn)新疆漢族及哈薩克族CLU rs9331888位點(χ2=0.680，P=0.7954，χ2=1.111，P=0.574)與AD有關(guān)聯(lián)性，我們的研究結(jié)果與Logue等[17]在非裔美國人中研究結(jié)果一致。有研究表明AD風(fēng)險rs9331888基因與CLU血漿水平下降相關(guān)，它還修飾了CSF中微管相關(guān)蛋白的tau水平和Aβ(1～42)下降，其結(jié)果表明CLU內(nèi)rs9331888多態(tài)性的次要等位基因(G)顯著與LOAD風(fēng)險增加有關(guān)，且在為期兩年的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)AD組中rs9331888處的SNPs與左側(cè)海馬體積顯著相關(guān)(P=0.004)[18]。一項關(guān)于土耳其人的研究顯示rs9331888與AD之間存在重要關(guān)系，GG基因型rs9331888可能增加發(fā)展AD的傾向，同時rs9331888的G等位基因與低凝聚素mRNA和血漿凝聚素水平相關(guān)；還觀察到更高的血漿凝聚素水平及凝聚素 mRNA水平與較低的MMSE相關(guān)，這表明較高的凝血素水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。有趣的是，一項在中國藏族人群研究發(fā)現(xiàn)rs9331888G基因可能降低AD的發(fā)病率[20]。不同種族的rs9331888位點驗證研究目前結(jié)論尚不一致。本研究未發(fā)現(xiàn)其關(guān)聯(lián)性可能的其他原因：(1)研究樣本量相對較少，尚不能充分體現(xiàn)新疆哈薩克族人群整體基因分布情況；(2)在人群篩選方面，目前AD診斷仍以癥狀為主，診斷標(biāo)準(zhǔn)以各類心理學(xué)檢測評分作參考，難免存在評分上的主觀性造成誤差；(3)新疆漢族及哈薩克族人群SAD可能與CLU 基因rs9331888位點多態(tài)性確實無關(guān)聯(lián)。

總的來說，這是在新疆漢族及哈薩克族人中進(jìn)行的為數(shù)不多相關(guān)性研究，研究發(fā)現(xiàn)CLU基因rs11136000位點多態(tài)性與SAD相關(guān)，攜帶T等位基因或者TT基因?qū)档凸_克族人SAD發(fā)病率有一定作用，但漢族SAD與哈族SAD等基因型及等位基因比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；CLU 基因9331888可能并非哈薩克族SAD的易感基因。