郭晶晶，張鵬飛，曹承旭，鄒婷婷，烏日娜

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽，110866)

乳酸菌(lactic acid bacteria)是一類革蘭氏陽性菌，不形成芽孢，能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生50%以上乳酸[1]。乳酸菌在自然界分布極為廣泛，不僅存在于食品中有利于食品發(fā)酵，改善食品風(fēng)味，提高食品保藏性和附加值，同時也存在于胃腸道中，是人體胃腸道的益生菌群，對人體健康具有很大的促進作用[2]。近年來，對乳酸菌的研究表明，乳酸菌具有很多生理功能，如增強機體免疫力，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，維持腸道內(nèi)菌群平衡，降低膽固醇，預(yù)防心血管疾病等，其中乳酸菌降膽固醇作用受到了越來越多國內(nèi)外學(xué)者的青睞[3]。

心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，占全球總死亡人數(shù)的29%左右，血清膽固醇水平升高被廣泛認為是動脈粥樣硬化、冠心病和中風(fēng)等心血管疾病的危險因素[4-7]。流行病學(xué)和臨床研究表明：在膽固醇含量與心血管疾病之間存在著顯著的正相關(guān)，血清膽固醇下降1%可將心血管疾病風(fēng)險下降3%[8-9]。越來越多的證據(jù)表明補充益生菌可以改善脂質(zhì)代謝，降低血清膽固醇含量。KIM等[10]通過動物試驗證明了益生菌混合物能夠明顯降低高血脂癥大鼠的血清膽固醇含量。LYE等[11]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌FTDC8312可以對抗高膽固醇血癥。有學(xué)者以蛋黃為原料，研究高粱發(fā)酵制品中的植物乳桿菌的降膽固醇特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋黃被試驗菌株同化了74.12%[12]。還有許多學(xué)者研究了來自發(fā)酵乳制品和泡菜等制品中的乳酸菌的降膽固醇特征[13-14]，但很少有關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中降膽固醇乳酸菌的研究，因此本試驗擬對東北自然發(fā)酵豆醬中的降膽固醇乳酸菌進行篩選和鑒定，并通過動物試驗進一步驗證其在體內(nèi)的降膽固醇作用，為今后降膽固醇產(chǎn)品的研發(fā)提供原料與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

分離自東北自然發(fā)酵豆醬的285株乳酸菌來源，如表1所示。

表1 285株乳酸菌來源及數(shù)目Table 1 The source and number of the 285 strains of lactic acid bacteria

1.2 實驗動物與飼料

32只5周齡清潔級雄性SD大鼠，體重約為120～135 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

高脂飼料(質(zhì)量分數(shù))：基礎(chǔ)飼料87.7%、膽固醇2%、豬油10%、膽酸鈉0.3%。

1.3 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基[15-16]、膽鹽培養(yǎng)基、膽固醇培養(yǎng)基、15%脫脂乳培養(yǎng)基。

人工胃液：取稀鹽酸，加蒸餾水稀釋使其pH值分別達到2.0、2.5、3.0，每100 mL液體中加1 g胃蛋白酶，充分溶解后，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾除菌，待用。

人工腸液：取KH2PO46.8 g，加蒸餾水500 mL溶解，用質(zhì)量濃度為4 g/L的NaOH溶液調(diào)pH值至6.8，加水稀釋至1 L，迅速加入牛膽鹽3 g，胰蛋白酶10 g，充分溶解后，用微孔濾膜(0.22 μm)過濾除菌，待用。

革蘭氏染色液：結(jié)晶紫染液、碘液復(fù)染液、95%乙醇溶液、番紅溶液。

CTAB法提取乳酸菌DNA所需試劑：10×TE緩沖液、10%SDS、20 mg/mL蛋白酶K、10 mol/L CTAB、酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)、冰異丙醇、70%乙醇、RNA酶、蒸餾水(滅菌)，其中，20 mg/mL蛋白酶K和RNA酶購于北京鼎國昌盛有限公司。

PCR程序所需的細菌通用引物：正向引物為27f (對應(yīng)于Escherichiacoil8-27 位堿基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為 1495r(對應(yīng)于Escherichiacoil1495-1515 位堿基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。TaKaRaExTaq酶、10×PCR buffer以及dNTP MIX等,均購于北京鼎國昌盛有限公司。

PCR產(chǎn)物檢測所需的瓊脂糖、EB等,均購于北京鼎國昌盛有限公司。

總膽固醇(totalcholesterol，TC)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein-cholesterol，HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein-cholesterol，LDL-C)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒,均購于南京建成生物工程研究所。

主要試劑：胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽、巰基乙酸鈉、鄰苯二甲醛。

1.4 儀器與設(shè)備

DZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；UV-4802紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；生物潔凈工作臺，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司；Centrifμge 5418R 小型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf；DNP-9080 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏試驗儀器有限公司；尼康生物顯微鏡，南京江南光電(集團)股份有限公司；冷藏冷凍箱，青島海爾股份有限公司；ND-100型微量紫外分光光度計，上海美析儀器有限公司；PTC-200型梯度基因擴增儀、電泳儀，美國伯樂公司；CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)，美國伯樂公司；ELX-800酶標儀，美國BIOTEK公司；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特公司；H-2050R超速冷凍離心機，湖南湘儀公司。

1.5 方法

1.5.1 試驗菌株初步篩選

將活化至3代的供試菌株制成菌懸液，以2%(體積分數(shù))的接種量接種于pH值為3.0 的新鮮配制的改良MRS液體培養(yǎng)基，置 37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察其生長情況。選擇在此條件下生長良好的菌株，以2%的接種量接種到新鮮配制的3 g/L牛膽鹽培養(yǎng)基中，置 37 ℃培養(yǎng) 24 h，觀察其生長情況。

1.5.2 人工胃液耐受性試驗

取初步篩選出的菌株，將活化好的菌懸液，以2%的接種量接種到經(jīng)過濾除菌處理的pH 2.0、pH 2.5和pH 3.0的人工胃液中，充分混勻后放置于 37 ℃培養(yǎng)。并在0、1、2、3 h 后分別取樣，傾注平板法進行活菌計數(shù)，按照公式(1)計算其存活率。

(1)

1.5.3 人工腸液耐受性試驗

取初步篩選出的菌株，將活化好的菌懸液，以2%的接種量接種到經(jīng)過濾除菌處理的人工腸液中，充分混勻后放置于 37 ℃培養(yǎng)。并在0、2、4、6 h后分別取樣，傾注平板法進行活菌計數(shù)，按照公式(2)計算其存活率。

(2)

1.5.4 降膽固醇試驗

1.5.4.1 標準曲線的繪制

用無水乙醇溶解膽固醇，使其終濃度為100 μg/mL。分別準確吸取0、100、200、300、400、500 μL膽固醇溶液于10 mL試管中，然后在60 ℃水浴加熱直至溶劑揮發(fā)盡，分別加入2 mL現(xiàn)配的鄰苯二甲醛溶液，混勻，靜置，加入1 mL濃硫酸，再次混勻，靜置。顯色后，用2 mL的鄰苯二甲醛溶液與1 mL濃硫酸的混合液調(diào)零，在560 nm處測OD值。繪制膽固醇濃度標準曲線。

1.5.4.2 樣品的制備與測定

取活化好的菌懸液，按2%接種量分別接種于膽固醇培養(yǎng)基中，同時以未接種菌體的膽固醇培養(yǎng)基為空白對照，37 ℃培養(yǎng)24 h。

取膽固醇培養(yǎng)基發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液，采用鄰苯二甲醛法，測定樣品在560nm處的OD值。重復(fù)試驗3次求平均值[17]，將OD值代入膽固醇標準曲線，求得膽固醇含量。最后和空白對照組的含量(未接種的膽固醇培養(yǎng)基的上清液中膽固醇的濃度)進行對比，計算膽固醇的去除率。

(3)

式中:A為各試驗菌株發(fā)酵后的培養(yǎng)液560 nm處OD值；A0為空白對照的OD值。

1.5.5 篩選菌株的形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化試驗

將活化好的菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1接種于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄其菌落特征。挑取單個菌落革蘭氏染色，觀察記錄菌體特征。

取試驗菌株活化后按照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊方法[18]，進行生理生化試驗。

1.5.6 利用16S rDNA序列分析

1.5.6.1 基因組DNA的提取及濃度的檢測

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethylammonium bromide，CTAB)法提取對數(shù)生長末期的乳酸菌的基因組DNA[19]。使用微量紫外分光光度計對分離得到的乳酸菌的DNA的濃度和純度進行測定，本研究中PCR擴增體系中DNA的濃度要求50 ng/μL，因此，只要測得的DNA濃度在50 ng/μL以上，即滿足PCR擴增體系的要求。同時，DNA純度的判斷主要依據(jù)OD260/OD280的比值，正常在1.6～1.8， 提取的DNA的純度最好。

1.5.6.2 PCR擴增

提取的乳酸菌DNA作模板，選擇通用引物進行PCR擴增，正向引物為27f(對應(yīng)于Escherichiacoil 8-27位堿基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1495r(對應(yīng)于Escherichiacoil1495-1515位堿基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′；擴增體系為25 μL：基因組DNA模板1 μL(50 ng/μL)，正反向引物各0.5 μL(25 pmol/μL)，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP MIX 2 μL，TaKaRaExTaq酶0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。

1.5.6.3 PCR產(chǎn)物檢測

擴增反應(yīng)完畢，將PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在1 500 bp有清晰的條帶后測序。

1.5.6.4 測序及乳酸菌同源性分析

供試菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物測序由上海桑尼生物技術(shù)有限公司完成。利用BLAST(http://DQ17-2w.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將分離得到的乳酸菌的16S rDNA序列測序結(jié)果同GenBank等數(shù)據(jù)庫中標準菌株的對應(yīng)序列進行同源性對比，從而獲得與測得的基因序列同源性最高的標準菌種[20]，完成乳酸菌的分子鑒定。

1.5.7 大鼠分組及飼喂方式

將活化后的菌株，生理鹽水洗滌2次，用無菌的15%脫脂乳培養(yǎng)基復(fù)溶成菌懸液，將菌體濃度調(diào)整至1.0×1010CFU/mL，用于大鼠灌胃實驗。32只SD大鼠12 h亮暗循環(huán)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度20～22 ℃，濕度60%～65%，保持動物房的通風(fēng)，透光和清潔衛(wèi)生。試驗前大鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按照各組之間平均體重?zé)o顯著差異分為4組：A組為正常對照組飼喂基礎(chǔ)飼料+無菌水，B組為高脂模型組飼喂高脂飼料+無菌水，C組為脫脂乳對照組飼喂高脂飼料+無菌脫脂乳，D組菌液干預(yù)組飼喂高脂飼料+菌懸液，每組8只。每只大鼠灌胃量為10 mL/kg，每天上午定時灌胃，連續(xù)灌胃12周。

1.5.8 樣品采集和指標檢測

每天記錄各組大鼠的攝食量，每周記錄體重。12周飼養(yǎng)結(jié)束后，稱量體重，禁食過夜，靜脈取血，用于血清血脂的檢測。解剖取肝臟、脾臟、腎臟和心臟，用冷的生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干水分分別稱重，計算臟器指數(shù)(各臟器重量/最終體重)。摘取腹部脂肪，腎周脂肪及附睪脂肪，分別稱重并計算脂肪系數(shù)(各脂肪重量/最終體重)。肝臟用液氮迅速冷凍，-80 ℃冰箱保存。按照試劑盒說明書的方法分別測定血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0系統(tǒng)統(tǒng)計軟件對各實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗。P<0.05為顯著性差異，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初步篩選結(jié)果

人體在進食后，胃液pH值大概在3.0左右，食物通過胃的時間大概在1～2 h，因此本試驗中，以pH 3.0，膽鹽濃度3 g/L設(shè)定為初篩的條件，篩選出耐酸耐膽鹽的乳酸菌。菌株生長情況如表2所示。

經(jīng)過耐酸試驗的初步篩選，有22株菌在pH值為3.0的培養(yǎng)基中生長較為良好，其中前10株菌的耐酸性最強，將前10株菌接種到3 g/L牛膽鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24 h后，菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1的耐膽鹽效果最好，因此選取此3株菌進行耐受人工胃腸液試驗。

表2 部分菌株在pH 3.0及3 g/L膽鹽MRS培養(yǎng)基中的生長情況Table 2 Survival rates at pH 3.0 and bile salt concentration 3 g/L

注：“+”越多表示生長情況越好;“ND”表示未做。

2.2 菌株耐受人工胃液結(jié)果

將菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-13分別接種到pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0的人工胃液中，37 ℃培養(yǎng)0、1、2、3 h后分別取樣，進行活菌計數(shù)，結(jié)果如表3。

表3 三株乳酸菌在人工胃液中存活情況(n=3，x±SD)Table 3 The survival abilities during human simulated gastric digestion(n=3，x±SD)

從表3中可以看出，在pH值為2.5和3.0的胃液中3株菌的活菌數(shù)都在107CFU/mL以上，說明這3株菌對人工胃液都有一定的耐受性。在相同的胃液中3株菌的存活率有所不同，其中DQ17-2在pH值為3.0的胃液中存活率最高，達到90.18%，DD1-1、KY1-1的存活率相對較低。這說明菌種之間存在著對胃酸的耐受差異性?？v向?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)隨著pH值的升高，3株菌的存活率也逐漸增加，這說明胃液酸度越大，對菌株的抑制作用越明顯，其中pH 2.0的人工胃液對菌株抑制作用最強。一方面，胃中鹽酸酸度越大，對菌體的脅迫越強。另一方面，胃蛋白酶在pH 2.0條件下，酶活力較高，從而更加抑制了細菌的生長。

2.3 菌株耐受人工腸液結(jié)果

將菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1分別接種到經(jīng)過濾除菌處理的人工腸液中，37 ℃培養(yǎng)0、2、4、6 h后分別取樣，進行活菌計數(shù)，結(jié)果如表4所示。

表4 三株乳酸菌對人工腸液液中存活情況(n=3，x±SD)Table 4 The survival abilities during human simulated intestional digestion

在人工腸液中，缺乏微生物生長必需的基礎(chǔ)養(yǎng)分，細菌無法增殖，另外受膽鹽與胰蛋白酶的抑制作用，細菌逐漸死亡。從表4中可以看出，3株菌在人工腸液中，隨著培養(yǎng)時間的延長，活菌數(shù)均處于下降的趨勢，但是下降的幅度不大，活菌數(shù)均在107CFU/mL以上，由此可見3株菌對腸液均有一定的耐受性。對比3株菌株之間的存活率可以發(fā)現(xiàn)，DQ17-2對人工腸液的耐受性仍然是3株菌中最強的，達到86.02%，與DD1-1的存活率相差不大，KY1-1的存活率最低。

2.4 菌株降膽固醇情況

2.4.1 膽固醇標準曲線的建立

通過標準膽固醇的濃度與對應(yīng)的OD550nm值建立一種線性關(guān)系，即膽固醇標準曲線如圖1所示。

圖1 膽固醇標準曲線Fig.1 The standard curve of cholesterol concentration

2.4.2 菌株降膽固醇結(jié)果

鄰苯二甲醛法測定3株菌發(fā)酵上清液膽固醇去除情況如表5所示。

表5 三株乳酸菌降膽固醇情況(n=3，x±SD)Table 5 Results of cholesterol-reducing test

由表5中可以看出3株菌都具有一定的降低膽固醇的能力，其中DQ17-2的膽固醇去除率最高，達到34.56%。植物乳桿菌體外降膽固醇的機理尚未完全被闡明，目前研究中同化吸收作用，以及共沉淀作用得到了大部分學(xué)者的認同[21-22]。因此該菌株體外降膽固醇的機理還有待進一步研究。

2.5 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

如圖2所示，菌種在MRS固體培養(yǎng)基上菌落較小，表面有光澤，凸起，微白色，濕潤，邊緣整齊，菌落呈圓形。經(jīng)過革蘭氏染色后(圖3)，在油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1菌體均呈紫色，屬于革蘭氏陽性菌，短桿狀，呈規(guī)則性的并排排列。

圖2 三株乳酸菌菌落形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Colony morphological characteristics of 3 LAB strains注:從左到右依次為菌株DD1-1; DQ17-2; KY1-1

圖3 三株乳酸菌株的革蘭氏染色菌體形態(tài)Fig.3 Morphology after gram stain of 3 LAB strains注:從左到右依次為菌株DD1-1; DQ17-2; KY1-1

2.6 供試菌株的生理生化鑒定結(jié)果

按照常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊方法進行生理生化試驗，結(jié)果如表6所示。

表6 三株菌株生理生化結(jié)果Table 6 Physiological and biochemical characteristics of 3 LAB strains

續(xù)表6

生理生化反應(yīng)DD1-1DQ17-2KY1-1半乳糖產(chǎn)酸+++麥芽糖產(chǎn)酸+++甘露糖產(chǎn)酸---山梨酸發(fā)酵---阿拉伯糖產(chǎn)酸+++甘露醇產(chǎn)酸---石蕊胨化---石蕊產(chǎn)酸---石蕊凝固---MR試驗+++V-P試驗---淀粉水解試驗---明膠液化試驗---厭氧生長試驗+++檸檬酸試驗---厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣---酪素水解試驗---吲哚試驗---氧化酶試驗---

注：“+”為陽性反應(yīng)；“-”為陰性反應(yīng)。

由供試菌株生理生化試驗結(jié)果，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對3株供試菌株進行鑒定，結(jié)果表明為乳桿菌屬(Lactobacillussp.)。為了使鑒定結(jié)果更精準，需要結(jié)合16S rDNA序列分析分子水平的鑒定，進一步對供試菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1的種屬進行確定。

2.7 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

用CTAB法提取供試菌株的總基因組DNA，測得菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1的DNA濃度分別為345.1、282.9、274.7 ng/μL，此外，3株乳酸菌DNA的OD260/OD280值分別為1.78、1.64、1.69，因此，滿足PCR擴增體系的要求，可以進行PCR擴增。

將提取的供試菌株的DNA進行PCR擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳方法對PCR產(chǎn)物進一步進行檢測。供試菌株DNA的PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖4。

M-DL2000 Markers;1-菌株DD1-1; 2-菌株DQ17-2; 3-菌株KY1-1圖4 16S rDNA PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis map of 16S rDNA amplification products

結(jié)果表明，在1 500 bp附近，電泳圖中呈現(xiàn)出明顯的發(fā)亮熒光條帶，證明供試菌株DNA的PCR結(jié)果較理想，可以進行下一步測序。

2.8 乳酸菌16S rDNA序列同源性對比結(jié)果

利用BLAST(http://DQ17-2w.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測定的3株菌株的16S rDNA序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rDNA/rRNA序列進行比較鑒定。詳細結(jié)果請見表7。

表7 乳酸菌16SrDNA序列同源性對比結(jié)果Table 7 The results of lactic acid bacteria 16SrDNA sequence homology comparison

由表7可以看出，菌株DD1-1、DQ17-2、KY1-1的16S rDNA序列與植物乳桿菌的同源性分別為100%、99%、99%，因此鑒定3株菌均為植物乳桿菌(L.plantarum)。將菌株DQ17-2命名為植物乳桿菌WW(L.plantarumWW)。

2.9 L. plantarum WW對大鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

在大鼠12周飼養(yǎng)期間未出現(xiàn)異常體征，試驗結(jié)束后大鼠的體重增加量，總攝食量的記錄結(jié)果如表8所示。

表8 各組大鼠的體重增加量、總攝食量 單位：gTable 8 Body weight gain and total food intake of rats in each group n=8)

注：同列字母不相同表示組間的差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

在4組大鼠12周的飼養(yǎng)過程中，每組大鼠體征正常，沒有死亡現(xiàn)象。由表8可知，4組大鼠初始體重沒有差異，在12周飼養(yǎng)結(jié)束后，相對于正常對照組，高脂模型組的最終體重顯著增加(P<0.05)，體重增加量也顯著升高(P<0.05)，總攝食量顯著增加(P<0.05)，這說明高脂飲食能夠引起大鼠體重的增加，初步確定高脂模型構(gòu)建成功；相對于高脂模型組和脫脂乳對照組，菌液干預(yù)組的攝食量和體重有所降低但差異不明顯(P>0.05)，說明飲食中的L.plantarumWW能夠抑制體重的增加。

2.10 L. plantarum WW對大鼠臟器指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響

解剖取肝臟、脾臟、腎臟和心臟，用冷的生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干水分分別稱重，計算臟器指數(shù)(各臟器重量/最終體重)。摘取腹部脂肪，腎周脂肪及附睪脂肪，分別稱重并計算脂肪系數(shù)(各脂肪重量/最終體重)。計算結(jié)果如表9所示。

表9 各組大鼠的臟器指數(shù)、脂肪系數(shù) 單位：%Table 9 Indexes of organ and fat of rats in each group n=8)

從表9中臟器指數(shù)可以看出，4組大鼠的心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)差異不明顯(P>0.05)，這說明L.plantarumWW對大鼠的心臟、腎臟和脾臟無毒副作用。從肝臟指數(shù)情況來看，高脂模型組和脫脂乳對照組肝臟指數(shù)明顯高于正常對照組和菌液干預(yù)組(P<0.05)，而且菌液干預(yù)組的肝臟指數(shù)略低于正常對照組，但差異不明顯(P>0.05)，這說明高脂飲食引起了脂肪在肝臟的堆積，而L.plantarumWW能夠有效的降低脂肪在肝臟的堆積，進而緩解肝臟的損傷。從脂肪系數(shù)來看，相對于正常對照組，高脂模型組和脫脂乳對照組大鼠的腹部脂肪系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)和附睪脂肪系數(shù)明顯升高(P<0.05)，而灌胃L.plantarumWW菌懸液后，腹部脂肪系數(shù)、腎周脂肪系數(shù)和附睪脂肪系數(shù)均明顯降低(P<0.05)，說明L.plantarumWW能夠有效降低高脂大鼠體內(nèi)的脂肪。

2.11 L. plantarum WW對大鼠血清血脂水平的影響

根據(jù)試劑盒說明書的方法測定每組大鼠血清中的TC、TG、LDL-L和HDL-C的含量，結(jié)果如表10所示。

表10 L. plantarum WW對大鼠血清血脂水平的影響(x±SD, n=8) 單位：mmol/LTable 10 Effect of L. plantarum WW on serum lipid level in rats (x±SD, n=8)

從表10中可以看出，高脂飲食大鼠血清中的TC、TG、LDL-C的含量明顯高于普通對照組(P<0.05)，說明高脂模型造模成功。與高脂模型組和脫脂乳對照組相比，菌液干預(yù)組血清中TC、TG、LDL-C的含量明顯降低(P<0.05)，相對于高脂模型組分別降低了28.92%、22.47%和28.99%，但明顯高于普通對照組(P<0.05)，這說明L.plantarumWW能夠有效降低高脂飲食引起的血脂水平的升高，但不能使其降低到正常水平。HDL-C主要功能是轉(zhuǎn)運磷脂和膽固醇，是一種抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，能促進外周組織中膽固醇的消除，防止冠心病的發(fā)生[23]。從上表中可以看出，菌液干預(yù)組血清中HDL-C的含量明顯高于高脂模型組和脫脂乳對照組(P<0.05)，說明L.plantarumWW能夠幫助降低患動脈粥樣硬化等心血管疾病的風(fēng)險。

3 結(jié)論與討論

在豆醬的發(fā)酵過程中，乳酸菌是比較重要的微生物，與風(fēng)味的形成有直接關(guān)系。對豆醬樣品細菌種屬水平分類分析顯示，在細菌的厚壁菌門中，乳桿菌目Lactobacillales占到70%，由此可見，乳酸菌尤其是乳桿菌屬在豆醬中非常豐富。其中，植物乳桿菌作為發(fā)酵食品中常見菌種，在豆醬中的分離率也非常高[24-25]。本試驗選擇從東北自然發(fā)酵豆醬中篩選出的285株乳酸菌作為試驗菌株，通過耐酸耐膽鹽試驗初步篩選出3株耐受性較強的菌株，編號分別為DD1-1、DQ17-2、KY1-1，并且在人工腸液和人工胃液中均具有較強的耐受性，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗和16S rDNA鑒定，結(jié)果顯示DD1-1、DQ17-2、KY1-1均為植物乳桿菌(L.plantarum)。

植物乳桿菌是一種公認的益生菌，存在于許多食品中，同時也存在于人體胃腸道中，對人體健康具有很大的促進作用[26]。植物乳桿菌具有很多生理功能，如增強機體免疫力，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，維持腸道內(nèi)菌群平衡等，研究表明植物乳桿菌也具有降低人體血清膽固醇的作用[27-28]。許多學(xué)者從高粱發(fā)酵產(chǎn)品、發(fā)酵乳制品、泡菜等產(chǎn)品中分離篩選出了具有降膽固醇作用的植物乳桿菌，并通過動物試驗進一步證實了篩選出的植物乳桿菌能夠降低高膽固醇小鼠的血脂水平[29-32]。然而植物乳桿菌降膽固醇的機理尚未完全被闡明，目前在體外降膽固醇的機理研究中同化吸收作用，以及共沉淀作用得到了大部分學(xué)者的認同[21-22]。在體內(nèi)降膽固醇的機理研究中張曉磊[33]研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵豆乳通過上調(diào)小鼠瘦素的mRNA表達水平來抑制SREBP-1的mRNA表達水平，同時促進TGH的mRNA表達水平，從而降低DGAT的mRNA表達水平，降低TG合成量的同時促進TG的分解，降低TG在肝臟和脂肪組織中的積累，從而來發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂水平和保護肝臟的作用。LI等[34]研究結(jié)果證實植物乳桿菌NCU116可通過調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白基因的表達來控制高脂飲食大鼠體內(nèi)膽固醇的升高。本試驗中篩選出的植物乳桿菌DD1-1、DQ17-2、KY1-1都具有一定的降低膽固醇的能力，其中DQ17-2降膽固醇能力最強，去除率達到34.56%，耐受性效果也最佳，將其命名為植物乳桿菌WW(L.plantarumWW)并進行動物試驗，進一步驗證該菌株對機體的降膽固醇作用。通過高脂飼料喂養(yǎng)12周后成功構(gòu)建高脂模型，與普通對照組相比血清TC、TG、LDL-C含量均明顯升高，HDL-C含量明顯降低。通過灌胃L.plantarumWW 12周后，與模型組和脫脂乳對照組相比，血清TC、TG和LDL-C的含量均明顯降低，HDL-C的含量明顯升高；從肝臟指數(shù)和脂肪系數(shù)方面可以看出菌液干預(yù)組的肝臟指數(shù)和各脂肪系數(shù)均明顯低于高脂模型組和脫脂乳對照組。因此說明L.plantarumWW能夠有效降低高脂飲食引起的血清血脂水平的升高以及脂肪在肝臟和體內(nèi)的堆積，進一步說明L.plantarumWW能夠幫助降低動脈粥樣硬化等心血管疾病的患病率，并且對肝臟有一定的保護作用，但該菌株在體內(nèi)外降膽固醇的主要機制，具體是一種機制還是多種機制共同作用，還需要進一步深入研究驗證。