馮 琛萬(wàn)嘉洋姚 玥張 涵陳天翔 丁志山 李曉紅 虞 立 劉 佳 金偉鋒△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053；5.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是清代醫(yī)學(xué)名家王清任所著，是中醫(yī)典籍《醫(yī)林改錯(cuò)》所載的經(jīng)典名方［1］。補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的治療已取得共識(shí)，位居中醫(yī)益氣活血類代表方之首［2-3］。許多學(xué)者開(kāi)展了大量的補(bǔ)陽(yáng)還五湯臨床應(yīng)用、作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等系列研究，結(jié)果表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療缺血性中風(fēng)具有較好療效，且用藥安全［4-6］。然而中藥復(fù)方乃至單味中藥成分復(fù)雜，有效成分含量甚少，何況有效成分往往不是單一成分，補(bǔ)陽(yáng)還五湯亦是如此。

研究表明，羥基紅花黃色素A（HSYA）、阿魏酸、芒柄花素均是補(bǔ)陽(yáng)還五湯中主要有效成分。HSYA是菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花中的主要有效成分［7］，具有抗心肌、腦缺血損傷［8］，抗腦血栓形成，抗腫瘤，調(diào)節(jié)脂代謝等藥理作用。阿魏酸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖中的主要有效成分［7］，具有抗氧化、清除自由基以及細(xì)胞保護(hù)等藥理作用［9］。芒柄花素是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 莢 黃 芪Artragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根的主要有效成分［7，10］，具有抗氧化，抗心腦血管等藥理作用［11］。

Dempster-Shafer（D-S）證據(jù)理論是一種研究不確定性問(wèn)題的完整理論。它不僅能夠強(qiáng)調(diào)事物的客觀性，還能強(qiáng)調(diào)人對(duì)事物估計(jì)的主觀性。D-S證據(jù)理論將互不相關(guān)的基本問(wèn)題組成的完備集合，表示對(duì)這一問(wèn)題的全部可能答案，即D-S證據(jù)理論模型的基本解題方法。其具有采用“區(qū)間估計(jì)”對(duì)不確定性信息進(jìn)行描述，而非“點(diǎn)估計(jì)”，在區(qū)別不知道、不確定和精確反映數(shù)據(jù)收集方面顯示出很大的靈活性等特點(diǎn)?，F(xiàn)今D-S證據(jù)理論已在通信工程、航天航空、能源再生等領(lǐng)域廣泛運(yùn)用［12-14］。遺傳算法（GA）是一種通過(guò)模擬生物自然進(jìn)化和遺傳過(guò)程，搜索局部乃至全局最優(yōu)解的方法和計(jì)算模型，是當(dāng)今人工智能領(lǐng)域中解決最優(yōu)化問(wèn)題的搜索啟發(fā)式算法［15］。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）是一種模仿高等生物大腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的數(shù)學(xué)或計(jì)算模型，其中誤差反向傳播算法（BPNN）模型是ANN中的一種監(jiān)督式的學(xué)習(xí)模型［16］。將GA與BPNN相結(jié)合，可使數(shù)據(jù)在多層結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中的局部范圍內(nèi)自動(dòng)訓(xùn)練、優(yōu)化尋找最佳結(jié)果。但在當(dāng)今人工智能大數(shù)據(jù)時(shí)代，將上述三者相結(jié)合的數(shù)學(xué)模型在中醫(yī)藥領(lǐng)域中還處于空白。

因此，本文采用D-S證據(jù)理論與GA-BPNN模型結(jié)合，對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中HSYA、阿魏酸、芒柄花素3種主要有效成分進(jìn)行提取工藝優(yōu)化、預(yù)測(cè)，得到最佳提取工藝，最后驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

1 儀器與材料

梅特勒XS205電子天平，METTLER TOLEDO國(guó)際有限公司；CASCADA BIOMK2超純水儀，美國(guó)PALL公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Waters Alliance高效液相色譜儀（2695分離單元、2489紫外檢測(cè)器、Waters Empower工作站），美國(guó)Waters公司。

HSYA對(duì)照品（批號(hào)SZ201702005QA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)20170503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），天津士蘭科技有限公司，阿魏酸對(duì)照品（CAS：1135-24-6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；黃芪 （甘肅，批號(hào)170901）、川芎（四川，批號(hào) 170901）、當(dāng)歸（甘肅，批號(hào)171101）、赤芍（內(nèi)蒙古，批號(hào) 180501）、桃仁（陜西，批號(hào) 180401），紅花（甘肅，批號(hào) 180401），地龍（廣東，批號(hào)180301），均購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬永敏研究員鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)范要求。

軟件為Matlab開(kāi)發(fā)的中藥材藥物提取數(shù)據(jù)優(yōu)選系統(tǒng)V2.0軟件，D-S證據(jù)理論程序包。

2 方法與結(jié)果

2.1 HSYA、阿魏酸、芒柄花素的HPLC同時(shí)測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，采用梯度洗脫程序：0～25 min，5%～18%乙腈；25～55 min，18～55%乙腈；55～70min，55～80%乙腈；70～80 min，80%乙腈； 流速 1.00 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫箱為25℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取HSYA、阿魏酸和芒柄花素對(duì)照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，充分搖勻，配成1 mg/mL的單一成分母液。分別精密吸取上述HSYA、阿魏酸對(duì)照品母液各2 mL，芒柄花素對(duì)照品母液1 mL，置于同一個(gè)10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度線，搖勻，得到混合對(duì)照品溶液（HSYA 0.20 mg/mL、阿魏酸 0.10 mg/mL、芒柄花素0.1 mg/mL）。

2.1.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方溶液提取制備 按照補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方藥材比例稱取藥材10 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入60%乙醇350 mL，稱取質(zhì)量，在80℃下熱回流提取2 h，室溫下冷卻，補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，抽濾，得到提取藥液。將藥液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，得到供試品溶液。

2.1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 儀器分別自動(dòng)進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各 10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。3種成分達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系的考察 混合對(duì)照品溶液作為1號(hào)溶液，對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行倍比稀釋，制成一系列質(zhì)量濃度溶液，即2～6號(hào)溶液。按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定物質(zhì)峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。HSYA：Y=5 946.87X-22.3486，R2=0.9995，在 0.02～0.20 mg/mL范圍內(nèi)具有較好線性關(guān)系；阿魏酸Y=50 458.12X-14.9545，R2=0.9989， 在 0.02～0.20 mg/mL 范圍內(nèi)具有較好線性關(guān)系；芒柄花素Y=57 127.25X+10.6913，R2=0.9991，在 0.002～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)具有較好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 自動(dòng)進(jìn)樣3號(hào)混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下條件重復(fù)進(jìn)樣 6次，記錄混合對(duì)照品溶液中HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色譜峰面積并計(jì)算RSD值分別為0.89%、0.43%、0.74%，表明精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液 1 份，按“2.1.1”項(xiàng)下條件分別在 0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色譜峰面積，供試品溶液色譜峰面積的RSD值分別為2.00%、1.88%、1.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方藥材 （同一批次）的比例稱取藥材10 g，精密稱取6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，高效液相色譜法測(cè)定，記錄HSYA、阿魏酸和芒柄花素的色譜峰面積，計(jì)算得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.65%、1.33%、2.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 按補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方藥材 （已測(cè)定的同批次藥材）的比例稱取藥材5 g，精密稱定，共6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備提取樣品溶液，每份各精密加入HSYA對(duì)照品1 mg、阿魏酸對(duì)照品0.50 mg和芒柄花素對(duì)照品0.05 mg，制備供試品溶液，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定，HSYA的平均回收率為108.57%，RSD為2.13%；阿魏酸的平均回收率為101.49%，RSD為1.84%；芒柄花素的平均回收率為98.98%，RSD為1.87%，說(shuō)明該方法回收率良好。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 因素水平設(shè)計(jì) 基于單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方中3種有效成分提取率的4個(gè)因素：提取時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取溫度（C）、液料比（D），最后進(jìn)行四因素五水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選最佳提取工藝。見(jiàn)表1。

2.2.2 試驗(yàn)方法 按補(bǔ)陽(yáng)還五湯復(fù)方藥材的比例稱取藥材8 g，共30份，按照響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行乙醇熱回流提取，放冷，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至盡干，用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到30個(gè)樣品溶液，密封置于冰箱內(nèi)備用。最后按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定HSYA、阿魏酸和芒柄花素的提取率。提取率＝各成分的量/生藥材量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 D-S證據(jù)理論方法下的權(quán)重賦值

各個(gè)成分進(jìn)行歸一化處理，即各成分的每個(gè)數(shù)除以這組數(shù)之和。然后依據(jù)D-S證據(jù)理論程序包求得歸一化常數(shù)K=0.0988，各成分相關(guān)系數(shù)：AHSYA=1/36 530，B阿魏酸=1/7 159.5，C芒柄花素=1/1 190.6。 最終得到權(quán)重賦值公式：綜合評(píng)價(jià)值=1/0.0988×提取率HSYA/36 530×提取率阿魏酸/7 159.5×提取率芒柄花素/1190.6×100 000，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果（n=3）

2.4 RSM軟件分析結(jié)果

采用Design-Expert.V8.0.6響應(yīng)面軟件對(duì)上述響應(yīng)面方法提取后計(jì)算得到的綜合評(píng)價(jià)值進(jìn)行分析：模型的P值＜0.0001，提取時(shí)間的PA為0.2073，乙醇濃度的PB為 0.5893，提取溫度的 PC為 0.0321，液料比的PD為0.0023，R2=0.9086。模型的方程為：綜合評(píng)價(jià)值=-3 194.14+35.95×A+9.91×B+62.97×C+12.52×D+0.12×A×B-0.09×A×C+2.24×A×D-0.03×B ×C-0.07×B×D+0.12×C×D-19.10×A2-0.06×B2-0.34×C2-0.83×D2。 同時(shí)得到預(yù)測(cè)結(jié)果為：提取時(shí)間1.7 h，乙醇濃度53%，提取溫度91℃，液料比14∶1，該條件下預(yù)測(cè)得到的綜合評(píng)價(jià)值為66.75。

2.5 Matlab環(huán)境下的模型優(yōu)化

本文采用Matlab開(kāi)發(fā)的中藥材藥物提取數(shù)據(jù)優(yōu)選系統(tǒng)V2.0軟件，其中包含BPNN工具包 （newff）和GA工具箱，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為3層（即輸入層：提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、液料比；中間層：隱層神經(jīng)元個(gè)數(shù)；輸出層：綜合評(píng)價(jià)值），不斷調(diào)整軟件中的參數(shù)使之符合實(shí)驗(yàn)需要。將30組數(shù)據(jù)的第1～27組（共27組）作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練數(shù)據(jù)，第28～30組（共3組）作為評(píng)判神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)劣的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，導(dǎo)入到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（參數(shù)設(shè)置：現(xiàn)實(shí)頻率為5，訓(xùn)練次數(shù)為100，訓(xùn)練目標(biāo)最小誤差為0.001，其余為默認(rèn)值）中，結(jié)合GA工具箱（參數(shù)設(shè)置：種群規(guī)模為100，最大迭代次數(shù)為1 000，滿意的適應(yīng)值為0.0005，梯度下降為10～15，其余為默認(rèn)值），不斷調(diào)整神經(jīng)元數(shù)量，對(duì)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行訓(xùn)練優(yōu)化，得到擬合誤差（%）、預(yù)測(cè)誤差（%）、總體誤差（%）、模型擬合率（R）等4個(gè)結(jié)果，見(jiàn)表4；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論數(shù)據(jù)擬合結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論數(shù)據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果

從表2可知，神經(jīng)元個(gè)數(shù)從1～6，擬合誤差由大變小后再變大，即出現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)中的過(guò)擬現(xiàn)象，當(dāng)神經(jīng)元為5時(shí)，結(jié)果都較其他神經(jīng)元個(gè)數(shù)時(shí)好，其擬合誤差為6.22%、預(yù)測(cè)誤差為3.46%、總體誤差為4.84%、模型擬合率R為0.9969；從圖2可知，當(dāng)神經(jīng)元變化從1～5時(shí)，所有的數(shù)據(jù)愈來(lái)愈靠近對(duì)角斜線（相關(guān)性斜線）；當(dāng)神經(jīng)元為5時(shí)，所有數(shù)據(jù)基本與相關(guān)斜線重合；而神經(jīng)元為6時(shí)，有些數(shù)據(jù)又開(kāi)始逐漸偏離相關(guān)性斜線，這也恰好印證了模型優(yōu)化參數(shù)在圖中的變化過(guò)程。因此，本文選取神經(jīng)元個(gè)數(shù)為5進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)。

表2 模型優(yōu)化參數(shù)

2.6 模型的目標(biāo)尋優(yōu)

基于上述神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，本文進(jìn)行實(shí)數(shù)編程，再次建立GA模型（參數(shù)設(shè)置：種群規(guī)模為100，最大迭代次數(shù)為1 000，滿意的適應(yīng)值為0.0005，梯度下降為10～15，其余為默認(rèn)值），進(jìn)行目標(biāo)結(jié)果尋優(yōu)。得到的結(jié)果如下：提取時(shí)間1.7 h，乙醇濃度50%，提取溫度90℃，液料比16∶1，網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)綜合評(píng)價(jià)值為77.20。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述得到的兩種提取優(yōu)化工藝條件，按復(fù)方比例稱取80 g藥材，共8份，進(jìn)行乙醇熱回流提取驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定各成分的提取率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，RSM法實(shí)驗(yàn)平均綜合評(píng)價(jià)值為70.82，其RSD為2.64%，預(yù)測(cè)值為66.75；GA-BPNN法下的實(shí)驗(yàn)平均綜合評(píng)價(jià)值為76.47，其RSD為1.49%，預(yù)測(cè)值為77.20。上述驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，RSM法的預(yù)測(cè)值較GA-BPNN模型低，且低于30組實(shí)驗(yàn)中的第3組，故尋優(yōu)結(jié)果較劣；RSM法的驗(yàn)證試驗(yàn)真實(shí)值也較差于遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的，故D-S證據(jù)理論下的遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)于響應(yīng)面法，即本文最佳的提取工藝條件選擇GA-BPNN模型所給出的結(jié)果，即提取時(shí)間1.7 h，乙醇濃度50%，提取溫度90℃，液料比16∶1。

表3 兩種方法最佳工藝下的驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié) 論

基于單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，最終選取提取時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度、液料比4個(gè)因素，采用四因素五水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，進(jìn)行乙醇熱回流提取補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的HSYA、阿魏酸、芒柄花素3種成分，得到的提取率利用D-S證據(jù)理論方法得到綜合評(píng)價(jià)值。利用RSM法和GA-BPNN模型同步對(duì)綜合評(píng)價(jià)值進(jìn)行最佳工藝優(yōu)化和預(yù)測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GA-BPNN模型得到的最佳提取工藝條件優(yōu)于RSM法。

本文基于D-S證據(jù)理論數(shù)據(jù)處理方法，采用當(dāng)前較為常用的RSM法和熱門的GA-BPNN模型對(duì)中藥復(fù)方補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的HSYA、阿魏酸、芒柄花素3種成分進(jìn)行提取工藝優(yōu)化和預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA-BPNN模型在中藥有效成分多目標(biāo)尋優(yōu)中效果顯著，簡(jiǎn)便快捷，這也為中藥有效成分多目標(biāo)尋優(yōu)、發(fā)現(xiàn)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化中藥研究提供了新的思路和參考。