李聰慧，崔詩遙，顧燕燕，解鴻青，屠振力，時(shí)連根

（浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

1 G蛋白偶聯(lián)受體的特性與種類

1.1 G蛋白偶聯(lián)受體的特性

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCRs）是一類高度保守、存在于細(xì)胞表面的膜蛋白超級(jí)家族，其數(shù)目和種類在細(xì)胞表面受體中為最多。在從低等真菌到高等哺乳動(dòng)物的生物體中，廣泛存在有GPCR，它通過與G蛋白的偶合來調(diào)節(jié)胞內(nèi)相關(guān)酶的活性，以此產(chǎn)生第二信使而將配體信號(hào)從胞外跨膜傳遞到胞內(nèi)，使細(xì)胞的功能活性發(fā)生改變，最終對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、滯育、攝食、代謝以及行為等起到調(diào)控作用。

GPCR由一條肽鏈組成，包含七個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，這七個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w分割為胞外N端、3個(gè)胞外環(huán)、胞內(nèi)C端和3個(gè)胞內(nèi)環(huán)。受體的胞外部分常帶有糖基化修飾，胞外環(huán)上存在的兩個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，可以通過形成二硫鍵對(duì)受體空間結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用。在受體的C端和連接（從肽鏈N端數(shù)起）第5和6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)（第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)）上，都有與G蛋白、GRKs、arrestin等下游信號(hào)分子結(jié)合的位點(diǎn)［1］。

1.2 G蛋白偶聯(lián)受體的分類

根據(jù)GPCR氨基酸序列的保守性及結(jié)構(gòu)特征，將GPCRs分為如下4個(gè)亞家族［2］：

1.2.1 A族受體

是目前已發(fā)現(xiàn)的最大的一類GPCR，含有大量的保守氨基酸，且在第一、二個(gè)胞外環(huán)之間由二硫橋連接。大多數(shù)受體的C端尾含有棕櫚?；陌腚装彼幔–ys），錨定于膜上。它的配體主要有生物氨基酸及核苷、多肽等。此類受體包括神經(jīng)肽受體、視覺色素受體等。

1.2.2 B族受體

有相對(duì)長(zhǎng)的氨基端，含有一些Cys位點(diǎn)，可以形成二硫鍵，形態(tài)類似于A族受體，但不含棕櫚?；稽c(diǎn)。主要配體有降鈣素、胰高血糖素、副甲狀腺素、利尿素等。

1.2.3 C族受體

有長(zhǎng)的氨基端及羧基端，除ECL1、ECL2的兩個(gè)亮氨酸形成二硫橋結(jié)構(gòu)外，C族受體不含A、B族受體的特征。主要包括谷氨酸鹽受體、γ-氨基丁酸受體、Ca2+受體等。

1.2.4 F/TAS族受體

N端較長(zhǎng)，結(jié)合Wnt糖蛋白。此類受體主要是味覺受體。

2 G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

經(jīng)典理論認(rèn)為，GPCR被配體激活后，構(gòu)象發(fā)生變化，然后與一種特異的三聚體G蛋白相偶聯(lián)。三聚體G蛋白由α、β、γ亞基組成，活化受體使得與α亞基結(jié)合的GDP轉(zhuǎn)化為GTP，并導(dǎo)致α亞基與β、γ亞基分離，受體偶聯(lián)的Gα以及分離的Gβ、Gγ分別引發(fā)不同的胞內(nèi)效應(yīng)體系，從而傳導(dǎo)配體信號(hào)。信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)束后，α亞基上的GTP酶水解GTP為GDP，α亞基重新與β、γ亞基親和形成三聚體G蛋白，復(fù)位等待下次信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。Gα是信號(hào)傳導(dǎo)過程中重要的一環(huán)，Gβ、Gγ主要參與下游的信號(hào)調(diào)節(jié)［4，5］。

配體和受體結(jié)合后所引發(fā)的胞內(nèi)效應(yīng)體系主要有以下3種：

2.1 PKA途徑

活化后的Gα（Gαs/Gαi/o）調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的CA（Adenylate Cyclase，腺苷酸環(huán)化酶）活性，活化/抑制胞內(nèi)ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷）轉(zhuǎn)化為 cAMP（Cyclic Adenosine Monophosphate，環(huán)磷酸腺苷），cAMP作為胞內(nèi)第二信使物質(zhì)，調(diào)節(jié)cAMP依賴的PKA（Protein Kinase A，蛋白激酶A）活性，接著采用磷酸化/去磷酸化的方式，對(duì)生物代謝通路、基因表達(dá)等多種效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控［6］。

2.2 PLC途徑

活化的Gα（Gαq）與膜上的肌醇PLC（Phospholi?pase C，磷脂酶C）偶聯(lián)，催化pIp2（Phosphatidylinosi?tol diphosphate，磷脂酰肌醇二磷酸）水解產(chǎn)生IP3（Inositol trisphosphate，三磷酸肌醇）和DAG（Diacyl?glycerol，甘油二酯）。IP3與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，打開Ca2+通路，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放到胞漿中，Ca2+也作為胞內(nèi)第二信使物質(zhì)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)各種酶的活性。DAG則與Ca2+以及結(jié)合在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂一起，激活PKC（Protein Kinase C，蛋白激酶C），PKC激活胞漿中的促有絲分裂蛋白激酶，參與下游的信號(hào)調(diào)節(jié)［7］。

2.3 受體門控離子通道途徑

活化的Gα（多為Gαi/Gαo）導(dǎo)致內(nèi)向整流K+（GIRKs）通道開放，或抑制電壓門控Ca2+通道。同時(shí)，Gβ、Gγ也參與GIRK通道的相關(guān)活化［8］。

GPCR的活性可以通過脫敏、復(fù)敏等來調(diào)節(jié)。受體脫敏的經(jīng)典模型主要包括三種機(jī)制：受體在蛋白激酶作用下磷酸化后，與其相應(yīng)的G蛋白不匹配；β-arrestin、GRK介導(dǎo)的質(zhì)/膜受體內(nèi)化；受體mRNA含量下降，通過減少合成量及降解已有受體的方法來導(dǎo)致胞內(nèi)受體組成下降。失活的受體也可通過去磷酸化、溶酶體內(nèi)加工等方式復(fù)敏，重新定位于膜上［9］。

3 G蛋白偶聯(lián)受體用于藥物作用靶標(biāo)

GPCR是跨膜蛋白受體的一個(gè)大家族，目前已發(fā)現(xiàn)涉及感覺、化學(xué)、刺激等成員800多個(gè)。在生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、滯育、神經(jīng)、精神等生命活動(dòng)以及內(nèi)分泌、代謝等生理過程中均有GPCR參與，同時(shí)糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫與感染性疾病、神經(jīng)與精神性疾病等的發(fā)生、發(fā)展、治療效果也與GPCR密切相關(guān)。為此，GPCRs成為了當(dāng)前最為重要的藥物作用靶標(biāo)庫。根據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，美國(guó)食品樣品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的藥物中共有475種藥物靶向GPCRs，約占FDA批準(zhǔn)藥物的34%；2011～2015年間，GPCRs藥物銷售額達(dá)9170億美元，銷售份額占全球總額的約27%；統(tǒng)計(jì)獲批藥物和臨床候選藥物作用靶點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)胺類受體如組胺受體、多巴胺受體、腎上腺受體、乙酰膽堿受體等為最大的藥物靶點(diǎn)，475種獲批藥物中的314種作用在該類受體上。

目前新藥開發(fā)的主要思路是篩選能抑制有害信號(hào)傳遞的物質(zhì)，例如：治療慢性心臟衰竭的Meto?prdol是一個(gè)針對(duì)β1視紫質(zhì)的反激動(dòng)劑，治療神經(jīng)分裂癥的Clozapine是一種反激動(dòng)劑［2］。藥物開發(fā)過程往往從一個(gè)與疾病相關(guān)的GPCR入手，尋找該通路的一些阻斷、激活分子，即找到新受體及其與疾病的關(guān)系，是開發(fā)新藥的先決條件。然而，由于有很多的代償途徑同時(shí)存在于人體內(nèi)，并且某個(gè)生理效應(yīng)可以由不同的受體所引發(fā)，所以將GPCR與疾病匹配還有許多難題。此外，雖然體外實(shí)驗(yàn)積累了大量的數(shù)據(jù)，但是藥物作用的是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體，需要有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的可靠證據(jù)才可以投入使用，同時(shí)需要大量的動(dòng)物缺失突變的模型來證實(shí)GPCR與疾病的關(guān)系［10］。

4 G蛋白偶聯(lián)受體研究的熱點(diǎn)

4.1 G蛋白偶聯(lián)受體功能篩選平臺(tái)

利用生物信息學(xué)的手段對(duì)日益充實(shí)完善的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，再以分子生物學(xué)方法克隆出許多GPCR基因，但為其匹配的相應(yīng)激動(dòng)劑、拮抗劑的研究相對(duì)滯后。目前已經(jīng)建立的激動(dòng)劑、拮抗劑篩選平臺(tái)主要有以下幾種［11］：

4.1.1 鳥苷酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)

該平臺(tái)用于檢測(cè)在激動(dòng)劑作用下與膜上GPCR結(jié)合的［35S］GTPγS。Larsen等用此方法在CHO細(xì)胞系上鑒定了果蠅中的兩個(gè)Allatostatin受體（DAR-1和DAR-2）［12］。該平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是：位于信號(hào)傳導(dǎo)途徑的上游，干擾因素較少。缺陷是：只對(duì)Gαi/o偶聯(lián)的受體比較靈敏，原因是該類受體GTP/GDP變化最快，量最大；實(shí)驗(yàn)要求分離自由態(tài)/結(jié)合態(tài)的［35S］GTPγS，具有放射性的危險(xiǎn)。

4.1.2 cAMP實(shí)驗(yàn)

該平臺(tái)基于對(duì)整個(gè)細(xì)胞內(nèi)cAMP的測(cè)量以及細(xì)胞膜上腺苷酸環(huán)化酶活力的測(cè)定，比較適用于Gαs偶聯(lián)的受體，但對(duì)于Gαi/o偶聯(lián)的受體需要用福斯高林（一種腺苷酸環(huán)化酶激活劑）進(jìn)行預(yù)處理。Beggs等利用這種方法鑒定了一個(gè)從蜜蜂中克隆到的D1型多巴胺受體，發(fā)現(xiàn)其有組成型活性［13］。

4.1.3 磷酸肌醇（IP）累積實(shí)驗(yàn)

該平臺(tái)適用于Gαq偶聯(lián)的GPCR的篩選。之前有利用IP3結(jié)合蛋白來測(cè)定IP3含量的模型，盡管此方法孵育時(shí)間短，但信/噪比高。所以，目前人們用IP1抗體來檢測(cè)IP1的累積。Trinquet等建立了一種基于D-myo-inositol 1 monophosphate的HTRF模型，與IP模型、Ca2+遷移模型比較，證明該模型是可行的［14］。

4.1.4 胞內(nèi)Ca2+實(shí)驗(yàn)

GPCR信號(hào)傳遞過程中往往伴隨著Ca2+的遷移，該平臺(tái)基于這種現(xiàn)象而建立。如水母發(fā)光蛋白在腔腸素存在時(shí)，能通過發(fā)熒光指示胞內(nèi)Ca2+的濃度變化。Radford等利用這個(gè)原理，在S2細(xì)胞中表達(dá)水母發(fā)光蛋白的讀碼框，檢測(cè)到Anopheles中白細(xì)胞激肽的受體［15］。隨著高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，使用Ca2+敏感性染料，以實(shí)時(shí)電偶儀（CCD）為基礎(chǔ)的熒光板閱讀器（FLIPR），自動(dòng)完成對(duì)Ca2+積累、胞外Ca2+進(jìn)入、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放的測(cè)量［16］。

4.1.5 報(bào)告基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)

該平臺(tái)是利用活化的第二信使激活報(bào)告基因的啟動(dòng)子來進(jìn)行檢測(cè)的，目前被利用的報(bào)告基因有β-半乳糖苷酶、熒光素酶、綠色熒光蛋白等。Hearn等用熒光素酶報(bào)告基因的方法，鑒定了一種多選擇性剪切的果蠅多巴胺型受體［17］。盡管已有1536孔自動(dòng)檢測(cè)儀用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)，但該平臺(tái)的處理時(shí)間較長(zhǎng)，并且對(duì)下游產(chǎn)物的檢測(cè)易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。

4.2 G蛋白偶聯(lián)受體的非放射性實(shí)驗(yàn)

雖然放射性標(biāo)記的靈敏度高，但存在放射性的危險(xiǎn)。因此，人們嘗試著將放射性標(biāo)記更換為熒光標(biāo)記。通過熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)受體進(jìn)行實(shí)時(shí)的胞內(nèi)定量、定位分析、結(jié)構(gòu)解析等，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。但熒光標(biāo)記有可能改變信號(hào)分子受體的藥理學(xué)效果，使體外實(shí)驗(yàn)不能反映出體內(nèi)的實(shí)際情形。同時(shí)，異源表達(dá)也可能會(huì)引發(fā)表達(dá)水平低、缺少互作蛋白、重復(fù)性低等許多問題。為此，建立起高通量、不含放射性、快速、精確、全面的篩選模型，是當(dāng)前藥物篩選開發(fā)的一個(gè)重要研究目標(biāo)。

4.3 G蛋白偶聯(lián)受體二聚化現(xiàn)象

GPCR尤其是結(jié)構(gòu)相似的GPCR，其異源二聚化現(xiàn)象很常見，例如C族GABAR88與味覺受體二聚化，B族降鈣素受體樣受體與RAMP二聚化等。二聚化可能改變受體的藥理學(xué)特性，例A族共表達(dá)的δ、μ-阿片受體，使得它們不能與任一單一配體結(jié)合，但在兩種配體同時(shí)加入時(shí)引發(fā)了強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)。有學(xué)者認(rèn)為，受體二聚化可能是GPCR與三聚體G蛋白偶聯(lián)的條件。但也有學(xué)者認(rèn)為，受體二聚化可能是體外實(shí)驗(yàn)時(shí)受體在細(xì)胞中過表達(dá)所形成的假象［2］。

新興技術(shù)BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）和FRET（熒光團(tuán)共振能量轉(zhuǎn)移），已經(jīng)被用于受體二聚化問題的研究。該二項(xiàng)技術(shù)的原理是：當(dāng)兩種物質(zhì)的距離足夠接近時(shí)，部分能量（熒光能/生物光能）能從供體轉(zhuǎn)移給受體。FRET依賴外源光的激發(fā)，BRET的供體熒光是熒光素酶氧化底物而發(fā)生的，均可用于考察蛋白質(zhì)間的相互作用，被廣泛地應(yīng)用于GPCR的二聚化研究領(lǐng)域［18］。Berthouze等利用BRET技術(shù)，發(fā)現(xiàn)5HT4受體的TM3與TM4間形成二硫橋的兩個(gè)Cys位點(diǎn)對(duì)其同源二聚化非常重要［27］。Hamdan等用BRET技術(shù)檢驗(yàn)12種GPCR內(nèi)吞時(shí)，發(fā)現(xiàn)10種受體發(fā)生了β-arrestin與β2-adaptin的結(jié)合［19］。

4.4 G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)研究

分析已解析的GPCR二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以將GPCR蛋白分子劃分成3部分：①胞外區(qū)，包含N端和3段胞外環(huán)區(qū)；②跨膜區(qū)，包含7段跨膜α螺旋；③胞內(nèi)區(qū)，包含3段胞內(nèi)環(huán)區(qū)、胞內(nèi)第8根螺旋和羧基端（C端）。胞外區(qū)域負(fù)責(zé)識(shí)別信號(hào)分子，跨膜區(qū)形成整個(gè)蛋白的骨架并負(fù)責(zé)結(jié)合配體、傳遞信號(hào)，胞內(nèi)部分與G蛋白、GRKs、arrestin等下游效應(yīng)分子結(jié)合以傳遞信號(hào)。GPCR的三維結(jié)構(gòu)解析，對(duì)于理解GPCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和基于其結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)具有十分重要的意義。但GPCR是跨膜蛋白，因此不易得到晶體，難以用X射線、NMR等方法測(cè)定其三維結(jié)構(gòu)。所以直到2000年才由Palczewski等從天然組織中提取牛視紫紅質(zhì)蛋白，與11-順式-視黃醛復(fù)合后得到復(fù)合晶體，從而解析出第1個(gè)GPCR的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)［20］。當(dāng)前獲得高質(zhì)量GPCR蛋白晶體的方法主要有三種：缺失（或點(diǎn)）突變法、融合蛋白法和盒式突變法。2007年Rosenbaum研究團(tuán)隊(duì)利用體外重組技術(shù)表達(dá)純化了人β2腎上腺素受體，并采用缺失（或點(diǎn)）突變法結(jié)合融合蛋白法，將影響蛋白穩(wěn)定性的氨基酸或氨基酸片斷刪除掉，同時(shí)將胞內(nèi)第3個(gè)柔性loop與抗體Fc片斷相融合，第一次獲得了穩(wěn)定的人β2腎上腺素受體晶體，從而解析出其3.7?的精細(xì)結(jié)構(gòu)［21，22］，該成果成為當(dāng)年世界十大科技進(jìn)展之一。Warnel等也采用點(diǎn)突變不穩(wěn)定氨基酸以及缺失突變較長(zhǎng)N末端、較長(zhǎng)C末端、胞內(nèi)loop，于2008年獲得了穩(wěn)定性高的火雞β1腎上腺素受體突變體，并解析出其2.7?的精細(xì)結(jié)構(gòu)［23］。盒式突變法是將GPCR蛋白跨膜螺旋表面的多個(gè)疏水殘基用親水殘基漸進(jìn)式定點(diǎn)替換，以獲得形態(tài)相似、功能相同、水溶性的GPCR蛋白突變體，從而進(jìn)一步解析出其精細(xì)結(jié)構(gòu)。盒式突變法目前還處于探索階段，至今還沒有用該方法成功解析出GPCR蛋白精細(xì)結(jié)構(gòu)的結(jié)果報(bào)道。缺失（或點(diǎn)）突變法、融合蛋白法和盒式突變法均或多或少地改變了原始蛋白的一些結(jié)構(gòu)，以此解析出的晶體結(jié)構(gòu)可能與其實(shí)際結(jié)構(gòu)存在一定的差別，但這并不會(huì)影響我們?cè)诟嗔私釭PCR蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系中，獲取重要、有用的參考資料。