賈廷印 李好朝 喬澤強(qiáng) 王立義

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院普通外科，南陽 473058)

肝細(xì)胞癌是最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的第三大主要原因[1-3]。目前對(duì)于肝細(xì)胞癌的治療主要以傳統(tǒng)的放療和化療為主，但由于肝癌細(xì)胞對(duì)大多數(shù)的放化療藥物不敏感，導(dǎo)致傳統(tǒng)療法收效甚微[4，5]。蛇床子素是從中藥蛇床子提取的一類香豆素衍生物，中醫(yī)常用其治療濕疹、皮膚瘙癢和滴蟲感染等疾病[6]?，F(xiàn)代研究表明蛇床子素具有抗炎、抗過敏、抗菌和抗骨質(zhì)疏松等藥理學(xué)活性[7-10]。此外，蛇床子素還能夠抑制多種癌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[11-13]。研究表明，蛇床子素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制肝癌細(xì)胞生長、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[14]，并且其還能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其作用機(jī)制與調(diào)控PTEN/Akt信號(hào)通路有關(guān)[15]。PTEN是一類抑癌基因，其在多種癌癥中都呈低表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)PTEN表達(dá)可減緩肝癌的發(fā)展[16-19]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛇床子素的抗肝癌作用與PTEN的關(guān)系進(jìn)行研究，從而為蛇床子素應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 CCK8試劑盒和BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。Ki67、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)、Bax、Bcl-2、磷酸酶-張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog gene，PTEN )一抗均購自美國Millipore公司。HRP標(biāo)記二抗購自美國Sigma公司。流式細(xì)胞儀購自德國Partec公司。電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞L02和人肝癌細(xì)胞HepG2由中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫提供。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，每3 d傳代一次。

1.2.2CCK8檢測細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板，并將細(xì)胞隨機(jī)分為0 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組和150 μmol/L組，每組6個(gè)復(fù)孔。每組分別加入相應(yīng)濃度的蛇床子素分別處理0、1、2、3、4和5 d，隨后每孔加入10 μl CCK8試劑，繼續(xù)孵育2 h后于450 nm處檢測細(xì)胞吸光度。

1.2.3流式檢測細(xì)胞凋亡 用蛇床子素同時(shí)加入或不加入PTEN抑制劑bpV(HOpic)(1 μmol/L)處理細(xì)胞48 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，0.25%胰酶收集細(xì)胞，用緩沖液重懸沉淀后，加入Annexin V和PI溶液室溫避光孵育10 min，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達(dá) 用PBS清洗細(xì)胞，RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度并調(diào)平。用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5% BSA封閉室溫蛋白質(zhì)，2 h后加入一抗(Ki67，1∶1 100；PCNA，1∶1 000；Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；PTEN，1∶1 000)4℃封閉過夜。第2天用TBST洗去一抗，加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響 為了探究蛇床子素的安全用藥濃度，我們檢測了蛇床子素對(duì)正常肝細(xì)胞L02活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)蛇床子濃度達(dá)到200 μmol/L 及以上時(shí)，L02活性明顯降至80%以下(表1)，因此選擇50 μmol/L、100 μmol/L和150 μmol/L三個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 100 μmol/L的蛇床子素作用4 d和5 d可明顯降低肝癌細(xì)胞增殖倍數(shù)(P<0.05，圖1)；150 μmol/L蛇床子素作用3、4和5 d也能明顯降低肝癌細(xì)胞增殖倍數(shù)(P<0.05，P<0.01，圖1)；同時(shí)，與0 μmol/L組比較，100 μmol/L組和150 μmol/L組細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67和PCNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖2)，且均體現(xiàn)量效關(guān)系。

表1 蛇床子素對(duì)正常肝細(xì)胞活性的影響

圖1 蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞活性影響Fig.1 Effect of osthole on cell viability of hepatoma carcinoma cells(HCC)Note: Cells were divided into 0 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L and 150 μmol/L group and treated with osthole for different times，CCK8 assay was performed for cell viability.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group；#.P<0.05 vs 150 μmol/L group.

圖2 蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of osthole on expressions of proliferation-related proteins of HCCNote: The protein levels of Ki67 and PCNA were measured by Western blot.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

圖3 蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of osthole of cell apoptosis of HCCNote: Cell apoptosis was determined by flow cytometry.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

2.2蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與0 μmol/L組比較，100 μmol/L組和150 μmol/L 組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05，P<0.01，圖3)，表明蛇床子素可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；同時(shí)，100 μmol/L組和150 μmol/L組細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白Bax的表達(dá)水平較0 μmol/L組比較明顯升高(P<0.05，P<0.01，圖4)，Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，P<0.01，圖4)，且具有量效關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of osthole on expressions of apoptosis-related proteins in HCCNote: The protein levels of Bax and Bcl-2 were determined by Western blot，GAPDH was used as loading control.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

圖5 蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞PTEN表達(dá)的影響Fig.5 Effect of osthole on expression of PTENNote: The expression of PTNE was determined by Western blot，GAPDH was used as loading control.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group.

2.3蛇床子素對(duì)PTEN表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛇床子素濃度為100 μmol/L和150 μmol/L時(shí)能顯著促進(jìn)抑癌基因PTEN的表達(dá)(P<0.05，P<0.01，圖5)，且具有量效關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4下調(diào)PTEN表達(dá)對(duì)蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖及促細(xì)胞凋亡作用的影響 為了探究蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖作用和促肝癌細(xì)胞凋亡作用與PTEN的關(guān)系，我們用PTEN抑制劑bpV(HOpic)下調(diào)PTEN表達(dá)并檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況。與0 μmol/L組比較，蛇床子素作用3 d、4 d和5 d后，150 μmol/L組細(xì)胞增殖倍數(shù)明顯降低(P<0.05，P<0.01，圖6)；與150 μmol/L組比較，150 μmol/L+bpV(HOpic)組細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著升高(P<0.05，圖6)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，bpV(HOpic)能明顯減弱蛇床子素對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用(P<0.05，圖7)。

圖6 bpV(HOpic)對(duì)蛇床子素抑制細(xì)胞增殖作用的影響。Fig.6 Effect of bpV(HOpic)on effect of osthole on cell proliferationNote: Cells was divided into 0 μmol/L，150 μmol/L and 150 μmol/L + bpV(HOpic)group and treated with osthole and bpV(HOpic).Cell viability was detected by CCK8 assay.n=6，*.P<0.05，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group;#.P<0.05 vs 150 μmol/L group.

圖7 bpV(HOpic)對(duì)蛇床子素促細(xì)胞凋亡作用的影響Fig.7 Effect of bpV(HOpic)on promotive effect of osthole on apoptosisNote: Flow cytometry was performed for cell apoptosis.n=6，**.P<0.01 vs 0 μmol/L group；#.P<0.05 vs 150 μmol/L group.

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，并且傳統(tǒng)的化療和放療對(duì)于肝癌的治療收效甚微[20]，因此，尋找新的藥物及治療方法是改善肝癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。蛇床子素是從傘科植物蛇床子果實(shí)中提取的一類香豆素衍生物，具有多種藥理學(xué)活性[21，22]。研究表明，蛇床子素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，還可通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12，23]。Lin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素還能誘導(dǎo)多種肝癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖。蛇床子素還可通過增加肝癌小鼠CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的數(shù)量增強(qiáng)肝癌小鼠自身的抗癌免疫力，提高肝癌小鼠存活率[24]。在本研究中，用不同濃度蛇床子素處理肝癌細(xì)胞HepG2后發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞活性，即抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并且體現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性。用不同濃度蛇床子素處理肝癌細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)，蛇床子素濃度達(dá)到100 μmol/L和150 μmol/L時(shí)能明顯降低細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67和PCNA的表達(dá)，提示蛇床子素能通過下調(diào)Ki67和PCNA的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖。此外，蛇床子素還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并隨濃度升高作用逐漸增強(qiáng)。蛇床子素還能促進(jìn)Bax表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平。Bax是一類凋亡誘導(dǎo)蛋白，Bcl-2能抑制凋亡的發(fā)生，其在多種癌癥中均呈高表達(dá)狀態(tài)[25-27]。提示蛇床子素能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，可能從而減緩肝癌的發(fā)展。

研究表明，蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用與多種細(xì)胞機(jī)制有關(guān)，如調(diào)控肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)DNA損傷和調(diào)控脂質(zhì)代謝等[6，28]。也有研究表明，蛇床子素調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖、凋亡與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)[29，30]。據(jù)報(bào)道，PTEN是PI3K/Akt信號(hào)通路的上游調(diào)控因子，PTEN過表達(dá)可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活抑制癌癥發(fā)生和癌細(xì)胞生長[31，32]。PTEN是一類抑癌基因，其可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、細(xì)胞周期等影響癌癥的發(fā)展[33]。并且PTEN表達(dá)的下調(diào)還與乳腺癌、前列腺癌等化療抵抗性的形成有關(guān)[19，34]。Lu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63 和SAOS-2 PTEN的表達(dá)，從而通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活抑制癌細(xì)胞增殖和遷移。并且肝癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)與肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[35]。PTEN過表達(dá)能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[16，36]，但蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞抑癌基因PTEN表達(dá)的影響還未見報(bào)道。本文研究結(jié)果表明，蛇床子素能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)，提示蛇床子素抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能與其誘導(dǎo)PTEN表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用bpV(HOpic)抑制PTEN表達(dá)后，蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用明顯減弱，進(jìn)一步證明蛇床子素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用與其誘導(dǎo)PTEN表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，蛇床子素能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用，并且其機(jī)制與上調(diào)抑癌基因PTEN的表達(dá)有關(guān)。本研究進(jìn)一步闡明了蛇床子素抗肝癌作用的作用機(jī)制，為蛇床子素應(yīng)用于肝癌的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。