孔 永 顏天銘 王玉玉 沈立軍 王 婧 邱玉華

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系，蘇州 215123)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由21～23 bp雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制[1]，采用RNAi技術(shù)可特異性抑制樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)表面共刺激分子表達(dá)，使其維持未成熟狀態(tài)和致免疫耐受性能，對(duì)于誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受、治療移植排異及自身免疫性疾病等具有重要的意義[2]。

DC是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)和唯一能直接激活初始T細(xì)胞的專職性抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell,APC)，其在免疫應(yīng)答/調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[3，4]。在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)多為未成熟DC(immature DC,iDC)，其表面中度表達(dá)MHCⅡ、不或低度表達(dá)B7-1/B7-2等共刺激分子，因其無法有效提供共刺激信號(hào)而不能激活T細(xì)胞，從而導(dǎo)致其凋亡、無能以及促進(jìn)機(jī)體免疫耐受的產(chǎn)生[5]。在病理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)炎性環(huán)境及抗原刺激DC發(fā)育成熟(mature DC,mDC)，導(dǎo)致T細(xì)胞活化增殖與免疫應(yīng)答，從而促進(jìn)疾病的發(fā)展[6]。

鑒此，本文構(gòu)建慢病毒載體及介導(dǎo)小鼠B7-2基因RNAi，并研究其對(duì)DC表面B7-2的干擾效應(yīng)以及對(duì)DC免疫性能的影響，為后續(xù)制備耐受性DC及應(yīng)用于自身免疫性疾病模型的免疫干預(yù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 293T細(xì)胞(ATCC)；6～8周齡C57BL/6小鼠(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；慢病毒載體系統(tǒng)(上海吉瑪制藥)；氨芐青霉素(Solarbio)；FBS及RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine2000 (Invitrogen)；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶(TaKaRa)；PE標(biāo)記抗小鼠CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2抗體(Biolegend)；Polybrene、MTT、LPS及DMSO(Sigma)；瑞氏染色試劑盒(碧云天生物)；重組小鼠GM-CSF及IL-4(Proptech)；尼龍毛柱(Polysciences)。

1.2方法

1.2.1序列選擇與雙發(fā)夾RNA模板設(shè)計(jì) 從GenBank鼠B7-2基因(NM_019388)的編碼區(qū)中選擇3段RNA干擾的靶序列：①長度為21個(gè)核苷酸；②GC含量30%～50%，不含連續(xù)的4個(gè)及以上T；③避免選擇起始密碼子下游和終止密碼子上游100個(gè)核苷酸區(qū)域序列；④將靶序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較，確保與其他基因無同源性；⑤選擇與小鼠B7-2無同源性序列作為檢驗(yàn)RNAi特異性的陰性對(duì)照。雙發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)模板由靶序列正向序列和反向互補(bǔ)序列通過環(huán)序列(TTCAAGAGA)相連接，并以6個(gè)T作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，同時(shí)在序列兩端分別添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。所設(shè)計(jì)DNA寡核苷酸序列由上海吉瑪公司合成。

1.2.2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 將合成的DNA寡核苷酸序列進(jìn)行退火形成shRNA前體DNA鏈。慢病毒表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切線性化后在T4 DNA連接酶作用下與模板雙鏈DNA進(jìn)行連接，隨后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌并置于氨芐LB培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，每靶點(diǎn)隨機(jī)挑取20個(gè)陽性克隆送Genescript公司進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.3重組慢病毒的制備與滴度測(cè)定 293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，待其處于對(duì)數(shù)期及60%～70%匯合時(shí)，重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及包裝輔助質(zhì)粒在Lipofectamine2000介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染細(xì)胞12 h，更換含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集48 h及72 h的培養(yǎng)上清，于4℃及50 000 g超高速離心2 h進(jìn)行濃縮。濃縮慢病毒經(jīng)10倍梯度稀釋感染293T后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，計(jì)數(shù)GFP陽性細(xì)胞數(shù)目并計(jì)算病毒滴度：病毒滴度(TU/ml)=(計(jì)數(shù)孔GFP+細(xì)胞數(shù)/感染病毒體積)×稀釋倍數(shù)。

1.2.4小鼠骨髓源DC的培養(yǎng)與鑒定 無菌分離C57BL/6小鼠脛、股骨，沖洗骨腔獲得骨髓，以200目篩網(wǎng)制備細(xì)胞懸液，隨后采用紅細(xì)胞裂解液處理及培養(yǎng)液洗滌獲得小鼠骨髓細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml-1，2 ml/孔接種于24孔板中并添加GM-CSF(20 ng/ml)及IL-4 (10 ng/ml)，培養(yǎng)48 h后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，吸棄懸浮細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基(含GM-CSF及IL-4)繼續(xù)培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)基，第6天換液時(shí)添加LPS(1 μg/ml)進(jìn)行成熟刺激，第8天收獲細(xì)胞。期間顯微鏡下監(jiān)控細(xì)胞生長狀態(tài)；收集第8天細(xì)胞流式分析其表面CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2的表達(dá)情況。

1.2.5重組慢病毒對(duì)DC感染效率的測(cè)定 參照1.2.4操作分離培養(yǎng)DC并于第6天時(shí)在Polybrene(5 ng/ml)輔助下慢病毒(LV-NC)以不同感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)(0、5、10、20、40、60)進(jìn)行感染12 h，隨后換液繼續(xù)培養(yǎng)60 h，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況并流式測(cè)定感染效率。

1.2.6重組B7-2基因RNAi慢病毒感染對(duì)DC表面B7-2表達(dá)的沉默效果及有效B7-2基因RNAi慢病毒的篩選 根據(jù)感染效率測(cè)定結(jié)果優(yōu)化感染條件后，3靶點(diǎn)RNAi慢病毒感染DC后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，流式分析其對(duì)細(xì)胞表面B7-2的沉默狀況以及確定具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒。

1.2.7重組B7-2基因RNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表達(dá)對(duì)DC免疫性能的影響 在96孔板中每孔接種2×104個(gè)慢病毒感染DC作為刺激細(xì)胞及2×105個(gè)尼龍毛柱吸附純化的小鼠脾臟T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h時(shí)每孔加入終濃度0.5 mg/ml的MTT溶液，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)棄除培養(yǎng)基并加入150 μl/孔 DMSO溶解結(jié)晶物并測(cè)定A490值。

2 結(jié)果

2.1重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 在小鼠B7-2基因編碼區(qū)選擇了3段RNAi靶序列，根據(jù)首個(gè)堿基的位置分別命名為139、425、848。隨后設(shè)計(jì)合成shRNA模板DNA序列并克隆至慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序鑒定重組載體中插入序列結(jié)構(gòu)及組成符合設(shè)計(jì)要求(圖1)。

2.2重組慢病毒的制備與滴度測(cè)定 重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒與包裝輔助質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h及48 h后可見GFP大量表達(dá)及重組病毒的成功包裝(圖2)，收獲48 h及72 h的培養(yǎng)上清并進(jìn)行超高速離心，病毒液得到濃縮，濃縮病毒液經(jīng)梯度稀釋感染293T細(xì)胞及檢測(cè)轉(zhuǎn)基因GFP的表達(dá)情況確定其滴度為(2～4)×108TU/ml(圖3)。

2.3小鼠骨髓源DC的培養(yǎng)與鑒定 小鼠骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)板后，光鏡下可見大小不一的細(xì)胞(圖4A)；第2天可見少量粒細(xì)胞集落形成(圖4B)；第3天集落繼續(xù)增多(圖4C)，此時(shí)輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)基以及懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)；第4天時(shí)可見具有伸展突起的巨噬細(xì)胞和少量成簇懸浮生長的幼稚DC(圖4D)；第5天集落中可見表面粗糙及具有少量細(xì)胞突起的DC(圖4E)；第6天時(shí)，集落中的DC開始釋放及懸浮生長并逐漸出現(xiàn)自發(fā)成熟的傾向(圖4F)，此時(shí)加入LPS進(jìn)行刺激培養(yǎng)。第7天時(shí)，DC表面刺突清晰明顯(圖4G)。第8天多數(shù)DC從集落中釋放，懸浮DC明顯增多，形態(tài)較大且刺突明顯，呈典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)(圖4H)。經(jīng)瑞氏染色后可見LPS刺激前(圖4I)后(圖4J)DC表面刺突變化明顯，LPS刺激后的DC呈典型的成熟形態(tài)。流式細(xì)胞分析表明LPS刺激前DC表面表達(dá)MHCⅡ(56.4%)、B7-1(15.2%)、B7-2(21.8%)及CD11c(64.7%)，經(jīng)LPS刺激成熟后MHCⅡ、B7-1、B7-2表達(dá)率上調(diào)，分別為84.0%、71.6%、74.0%(圖5)。

2.4重組慢病毒對(duì)小鼠骨髓源DC的感染效率測(cè)定 將收獲的第6天DC用重組慢病毒LV-NC以不同的MOI進(jìn)行感染并培養(yǎng)72 h以使轉(zhuǎn)基因充分表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察顯示隨著感染MOI的增加，表達(dá)GFP的DC逐漸增多(圖6)，同時(shí)流式細(xì)胞分析結(jié)果也表明感染效率的提高，在MOI為5、10、20、40、60時(shí)感染效率分別為7.1%、25.3%、62.2%、72.8%及86.4%。

2.5重組B7-2基因RNAi慢病毒感染對(duì)DC表面B7-2表達(dá)的沉默效果分析 參照陰性對(duì)照慢病毒對(duì)DC的感染效率，重組慢病毒LV-139、LV-425、LV-848及LV-NC以MO為80感染DC及培養(yǎng)72 h，流式分析各組重組慢病毒對(duì)DC表面B7-2的干擾效率，結(jié)果顯示(圖7)：感染效率進(jìn)一步提高至90%以上，LV-139、LV-425、LV-848感染后DC表面B7-2分子的表達(dá)率分別下降至4.3%、3.8%和6.3%，而LV-NC感染組B7-2分子表達(dá)率無明顯變化(73.2% vs 71.0%)。根據(jù)以上結(jié)果確定LV-425為具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒。

圖1 小鼠B7-2 RNAi重組慢病毒表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果Fig.1 DNA sequencing of recombinant lentiviral vector specific for mouse B7-2 RNAi

圖2 慢病毒包裝過程中GFP的表達(dá)(48 h，×100)Fig.2 GFP expression in lentivirus packaging progress(48 h，×100)

圖3 重組慢病毒滴度測(cè)定(×100)Fig.3 Titration of recombinant lentivirus(×100)

圖4 體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源DC形態(tài)的變化(×400)Fig.4 Morphological changes of mouse BM-DCs in progress of culture in vitro(×400)

圖5 小鼠骨髓源DC的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of mouse BM-DCs

2.6重組B7-2基因RNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表達(dá)對(duì)DC免疫性能的影響 收獲LPS刺激成熟和經(jīng)LV-425或LV-NC感染的DC作為刺激細(xì)胞，以小鼠脾臟T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，二者比例為 1∶10 進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，共培養(yǎng)72 h后采用MTT測(cè)定細(xì)胞增殖的狀況，結(jié)果顯示(圖8)：LV-425感染及沉默B7-2表達(dá)后DC刺激T的增殖能力顯著下降(P<0.05)。

圖6 重組慢病毒LV-NC對(duì)小鼠骨髓源DC的感染效率Fig.6 Infection efficiency of recombinant lentivirus LV-NC on mouse BM-DCs

圖7 小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對(duì)小鼠骨髓源DC表面B7-2分子表達(dá)的沉默效果分析Fig.7 Silencing efficiency analysis of recombinant lentivirus for mouse B7-2 gene RNAi on expression of membrane B7-2 molecules in mouse BM-DCs

圖8 重組慢病毒感染抑制小鼠骨髓源DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖反應(yīng)Fig.8 Inhibitory effects of recombinant lentivirus on mouse bone marrow derived dendritic cell induced T cell proliferationNote: *.P<0.05.

3 討論

1973年，Steinman等[7]首次從小鼠脾臟中分離出DC，隨著研究的不斷深入，DC在免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)以及免疫耐受誘導(dǎo)中發(fā)揮的功能逐漸被重視[3,4]。未成熟DC具有強(qiáng)大的抗原攝取及加工處理能力，但由于其表面MHCⅡ、B7-1、B7-2、ICAM-1、CD40等弱表達(dá)，不能為T細(xì)胞活化提供有效的第一信號(hào)和共刺激信號(hào)，從而導(dǎo)致特異性T細(xì)胞無反應(yīng)、發(fā)生凋亡或產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生[5]。由于未成熟狀態(tài)的DC具有致免疫耐受的能力，因而采用基因修飾的方法維持DC的未成熟狀態(tài)或部分抑制其免疫刺激能力，能夠在器官移植排異和自身免疫病的防治中起到積極的作用[8]。

慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)具有慢病毒的感染細(xì)胞譜廣泛、可感染分裂期和靜止期細(xì)胞、高感染效率等特點(diǎn)以及RNAi的特異性沉默性能，成為DC基因修飾及誘導(dǎo)免疫耐受的理想手段[2]。

B7-2是B7家族的重要成員和經(jīng)典的共刺激分子，該分子與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)對(duì)于免疫反應(yīng)初期T細(xì)胞應(yīng)答與否具有關(guān)鍵作用，是T細(xì)胞啟動(dòng)免疫所必需的[3,4]。因此，本研究選擇B7-2作為DC修飾和免疫干預(yù)的靶點(diǎn)，構(gòu)建小鼠B7-2基因RNA干擾的shRNA重組慢病毒載體，采用四質(zhì)粒慢病毒載體系統(tǒng)(LV-H1-GFP-B7-2-shRNA、GAG/POL、LV-REV及LV-VSV-G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝制備。由于本研究中的慢病毒系統(tǒng)使用的是水泡性口炎病毒G糖蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G)改型的包膜質(zhì)粒，使得重組慢病毒顆粒的穩(wěn)定性提高[9]，因此，我們采用超高速離心的方法對(duì)其進(jìn)行濃縮以提高滴度，隨后本研究采用可以反映具有感染活性病毒的細(xì)胞生物學(xué)方法測(cè)定病毒滴度。

為進(jìn)一步研究小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對(duì)DC表面B7-2分子表達(dá)沉默效果和誘導(dǎo)其免疫耐受的作用，我們從6～8周齡的C57BL/6小鼠脛骨、股骨中分離富含CD34+干/祖細(xì)胞的骨髓細(xì)胞，采用細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-4)誘生法進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，根據(jù)DC的半黏附生長，T、B細(xì)胞及粒細(xì)胞懸浮生長，而巨噬細(xì)胞黏附生長的特性，在骨髓細(xì)胞培養(yǎng)48 h后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板以使T、B細(xì)胞及粒細(xì)胞懸浮進(jìn)而吸棄，培養(yǎng)至第6天用LPS刺激48 h，集落中細(xì)胞體積增大，表面突起明顯，并逐漸從集落中釋放，吹打培養(yǎng)板使疏松貼壁的細(xì)胞充分懸浮，即獲得大量DC。經(jīng)顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察及瑞氏染色鑒定，本法制備的DC表面刺突明顯，為典型的成熟狀態(tài)。同時(shí)本研究選擇CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2組合標(biāo)記以鑒定所培養(yǎng)的DC，流式分析結(jié)果顯示其表達(dá)率分別達(dá)68.5%、84.0%、1.6%及77.40%，該DC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中也顯示出了刺激小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的能力，說明本方法成功制備的DC為成熟的功能性DC。

慢病毒載體既可感染分裂細(xì)胞又可感染靜止期細(xì)胞，對(duì)DC有較高的感染效率[10]，本研究制備的重組慢病毒以不同MOI感染DC，通過GFP標(biāo)記觀察轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況并流式分析病毒感染效率，結(jié)果表明，隨著MOI的增加其感染效率逐漸升高，經(jīng)過優(yōu)化條件后感染效率可達(dá)90%以上。

本研究隨后采用小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒LV-139、LV-425、LV848及LV-NC感染小鼠骨髓源DC，結(jié)果顯示：其表面B7-2分子的表達(dá)率由71%分別下降至4.3%(LV-139)、3.8%(LV-425)及6.3%(LV-848)，而LV-NC感染組B7-2表達(dá)無明顯變化(73.2% vs 71.0%)，這表明了本研究制備的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒可有效沉默B7-2分子的表達(dá)。同時(shí)混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果顯示：經(jīng)篩選獲得的具有最佳效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒(LV-425)感染后可以顯著抑制DC刺激小鼠脾臟T細(xì)胞增殖的能力，說明該重組慢病毒誘導(dǎo)的B7-2沉默能抑制B7-2所介導(dǎo)的共刺激信號(hào)與DC刺激T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，使DC獲得免疫耐受性能。

綜上，本研究制備了針對(duì)小鼠B7-2基因RNAi的重組慢病毒，其可高效感染體外誘導(dǎo)小鼠骨髓源DC、沉默DC表面B7-2表達(dá)及誘使DC具備免疫耐受性能。本研究為采用慢病毒載體介導(dǎo)B7-2基因沉默的方式修飾DC及誘導(dǎo)其免疫耐受應(yīng)用于病理性免疫耐受失衡的自身免疫性疾病、器官移植排異治療研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。