崔春梅 李月華 劉 穎 陶 勇

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院眼科，北京 100020)

多種眼部疾病及腫瘤壓迫、機(jī)械性損傷等可引起視神經(jīng)損傷，患者的視神經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷后可引起視神經(jīng)的萎縮，易造成失明，目前臨床上有效的治療視神經(jīng)損傷的方法不多，且達(dá)不到預(yù)期的效果[1,2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells，RGCs)位于視網(wǎng)膜底層，有研究顯示，視神經(jīng)損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼等多種疾病均可引起RGCs的凋亡，而RGCs在受損的視神經(jīng)中的再生比較困難[3-5]。因此，如何降低視神經(jīng)受損后RGCs的凋亡成為研究熱點(diǎn)。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是環(huán)氧合酶的誘導(dǎo)酶，在炎癥過程中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)血管的生成，因而成為血管增生性疾病治療的一個(gè)新型候選藥物。此外，也有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可導(dǎo)致視網(wǎng)膜的損傷[6,7]。NS-398是COX-2的一種選擇性抑制劑，有研究顯示，NS-398可降低NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層神經(jīng)元凋亡，從而對(duì)視網(wǎng)膜起到保護(hù)作用，也可抑制視網(wǎng)膜新生血管形成[8,9]，但NS-398如何調(diào)控RGCs生物學(xué)特性目前還未清楚。RGC-5細(xì)胞在RGCs研究中有廣泛應(yīng)用，有多種細(xì)胞凋亡模型，如H2O2損傷模型、高血糖損傷模型等，其中H2O2細(xì)胞凋亡模型在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用最為廣泛，且在大量研究中也使用此模型研究RGCs凋亡。因此，本研究建立H2O2誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡，檢測NS-398對(duì)細(xì)胞活力及凋亡的影響，并進(jìn)一步探討對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細(xì)胞購自美國ATCC；H2O2(10 mol/L)購自廣州化學(xué)制藥廠；NS-398(純度>98%)購自美國Sigma，用DMSO溶解；SB203580購自上海西寶生物科技；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶、MTT和NS-398購自美國Sigma公司；細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p53、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)、p-p38抗體均購自美國Cell signal公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取出在液氮罐中保存的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)RGC-5細(xì)胞的凍存管，37℃水浴解凍，細(xì)胞解凍后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，觀察到細(xì)胞達(dá)到80%～90%生長密度時(shí)可進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)為生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2H2O2損傷模型建立 接種RGC-5于96孔板，培養(yǎng)24 h后以0、200、300、400、600、800 μmol/L的H2O2濃度處理細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)7 h后將原培養(yǎng)基吸出，加入含有MTT溶液的DMEM培養(yǎng)基(不含血清)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h以使細(xì)胞能與MTT充分反應(yīng)，吸出MTT后加入150 μl的DMSO溶液，振蕩器振蕩混勻10 min，酶標(biāo)儀測定各濃度的細(xì)胞吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活力的影響 實(shí)驗(yàn)分為3組：即空白對(duì)照組(DMSO+含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞7 h)、H2O2組(DMSO+含有400 μmol/L的H2O2及10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞7 h)、H2O2+NS-398組(含有400 μmol/L的H2O2及100 μmol/L的NS-398培養(yǎng)細(xì)胞7 h)。每孔細(xì)胞中加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，加入DMSO溶液150 μl，振蕩器上充分混勻10 min，酶標(biāo)儀測定A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡的影響 收集按照1.2.3分組培養(yǎng)7 h的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞3 min，觀察到細(xì)胞變圓時(shí)，吹打細(xì)胞使細(xì)胞懸浮在消化液中，含血清的培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，細(xì)胞消化完全后離心，輕輕吸取上清，加入200 μl的Loading buffer制備成單細(xì)胞懸液，置于避光環(huán)境中加入FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μl，避光環(huán)境中反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡(Western blot) 各組細(xì)胞中加入適量裂解液于冰上裂解30 min提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行粗略定量，4∶1比例混勻蛋白樣品與上樣緩沖液，100℃煮沸變性5 min，每孔道取等量蛋白樣品行SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育PCNA、p53、p38、p-p38及內(nèi)參GAPDH抗體過夜，洗膜，加入二抗37℃孵育2 h，洗膜，ECL顯色液顯色，置于暗室中顯影曝光條帶。

1.2.6COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的調(diào)控RGC-5細(xì)胞經(jīng)H2O2、NS-398和p38MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580(10 μmol/L)處理，細(xì)胞分為H2O2+NS-398組和H2O2+NS-398+SB203580組，參照1.2.3和1.2.4方法檢測兩組細(xì)胞的活力和凋亡率。

2 結(jié)果

2.1不同濃度H2O2對(duì)RGC-5細(xì)胞活力的影響 不同濃度的H2O2處理RGC-5細(xì)胞后，通過MTT法檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果如表1所示，與0 μmol/L組比較，不同濃度的H2O2均可抑制RGC-5細(xì)胞活力，且隨H2O2濃度升高細(xì)胞的活力降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于400 μmol/L的H2O2可抑制一半的細(xì)胞活力，選擇作為研究對(duì)象。

2.2COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活力和凋亡的影響 通過MTT法檢測COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活力的影響，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖1所示，與空白對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高，與H2O2組比較，H2O2+NS-398組細(xì)胞活力顯著升高，凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響 通過Western blot檢測 COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白p53及p38和p-p38的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，與空白對(duì)照組比較，H2O2組PCNA表達(dá)顯著降低，p53和p-p38的表達(dá)顯著升高，與H2O2組比較，H2O2+NS-398組PCNA表達(dá)顯著升高，p53和p-p38的表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。三組間p38的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同濃度H2O2對(duì)RGC-5細(xì)胞活力的影響

Note：Compared with 0 μmol/L,1)P<0.05.

圖1 COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活力和凋亡的影響Fig.1 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on activity and apoptosis of RGC-5 cells induced by H2O2Note: A.Cell viability；B.Detection results of flow cytometry;C.Cell apoptosis rate in each group.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the H2O2group,#.P<0.05.

圖2 COX-2抑制劑NS-398對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on expression of PCNA,p53,p38 and p-p38 proteins in RGC-5 cells induced by H2O2Note: 1.Control group;2.H2O2group ;3.H2O2+NS-398 group.A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of each protein.Compared with the control group,*.P<0.05;compared with the H2O2group,#.P<0.05.

圖3 COX-2抑制劑NS-398通過p38MAPK信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on apoptosis of RGC-5 cells induced by H2O2through p38MAPK signaling pathway

圖4 COX-2抑制劑NS-398通過p38MAPK信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of COX-2 inhibitor NS-398 on expression of PCNA,p53,p38 and p-p38 protein in H2O2induced RGC-5 cells through p38MAPK signaling pathwayNote: A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of each protein.1.H2O2+NS-398 group;2.H2O2+NS-398+SB203580 group.Compared with the H2O2+NS-398 group,*.P<0.05.

2.4COX-2抑制劑NS-398通過p38MAPK信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞活力和凋亡的影響 各組細(xì)胞活力及凋亡率檢測結(jié)果如圖3所示，與H2O2+NS-398組比較(68.77±5.22)%、(3.63±0.37)%，H2O2+NS-398+SB203580組細(xì)胞活力(86.46±6.17)%顯著升高，細(xì)胞凋亡率(2.44±0.31)%顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=3.792，t2=4.270，P<0.05)。

2.5COX-2抑制劑NS-398通過p38MAPK信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞PCNA、p53、p38、p-p38蛋白表達(dá)的影響 各組細(xì)胞中PCNA、p53、p38、p-p38的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與H2O2+NS-398組比較，H2O2+NS-398組+SB203580組PCNA的蛋白表達(dá)顯著升高(t=6.940,P<0.05)，p53和p-p38的蛋白表達(dá)均顯著降低(t1=8.197，t2=6.063，P<0.05)，兩組間p38的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.388，P>0.05)。見圖4。

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種自然死亡過程，既可由生理性引起，也可由病理刺激引起[10]。有研究證實(shí)，RGCs的死亡可通過細(xì)胞凋亡的方式，Caspase、p53等細(xì)胞內(nèi)部基因均可直接對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控，而外部因素則可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控[11,12]。氧化應(yīng)激為一種細(xì)胞外部因素，參與白內(nèi)障、青光眼、干眼癥、角膜炎等多種眼部疾病[13-15]。H2O2為一種引起細(xì)胞凋亡的介質(zhì)，可通過氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡，也有多項(xiàng)研究證實(shí)氧化應(yīng)激可引起RGCs的凋亡[16]。COX-2主要分布于核膜，內(nèi)皮素、生長因子、促腫瘤劑等多種因素均可引起COX-2基因的表達(dá)，COX-2的高表達(dá)可參與多種生理及病理過程[17,18]。有研究顯示，在糖尿病大鼠模型中隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，COX-2的表達(dá)升高，COX-2在大鼠角膜新生血管中表達(dá)升高，而美洛昔康可抑制其作用[19]。NS-398為一種新型的COX-2的抑制劑，可特異性的抑制COX-2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，有研究顯示，在研究角膜新生血管模型中，NS-398可降低COX-2表達(dá)，通過阻斷VEGF和PGE2的產(chǎn)生而抑制角膜新生血管化[20,21]。但NS-398對(duì)RGCs的影響還未清楚。

本研究中通過H2O2刺激RGC-5，建立H2O2誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞凋亡，檢測NS-398對(duì)細(xì)胞活力及凋亡的影響。結(jié)果顯示H2O2可降低RGC-5細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而NS-398可提高細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡。這提示COX-2的抑制劑NS-398可降低由H2O2誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞的凋亡，提高細(xì)胞活力。p38MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)系統(tǒng)，活化的p38信號(hào)通路可引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)及炎癥，或引起細(xì)胞凋亡、衰老等，在糖尿病視網(wǎng)膜病變形成及發(fā)展中有重要作用[22,23]。SB203580為p38MAPK信號(hào)抑制劑，有研究顯示，SB203580可通過對(duì)下游p53、PCNA等因子的調(diào)節(jié)減輕糖尿病鼠視網(wǎng)膜RGCs凋亡及破壞[24]。

PCNA是細(xì)胞分裂增殖的一個(gè)必要條件，現(xiàn)多用其作為細(xì)胞增殖評(píng)價(jià)的指標(biāo)[25]。p53為一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，在對(duì)青光眼模型RGCs凋亡進(jìn)行觀察時(shí)，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上有p53的表達(dá)[26]。本研究結(jié)果顯示，H2O2可上調(diào)磷酸化的p38和p53表達(dá)，下調(diào)PCNA表達(dá)，而NS-398可降低其表達(dá)。RGC-5細(xì)胞加入SB203580可增加細(xì)胞活力，降低細(xì)胞的凋亡，上調(diào)PCNA表達(dá)和下調(diào)p53表達(dá)。這提示COX-2抑制劑NS-398可通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)影響RGC-5細(xì)胞生物學(xué)特性。

綜上所述，抑制免疫抑制因子COX-2表達(dá)可通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力和抑制細(xì)胞凋亡。其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響方式是上調(diào)PCNA表達(dá)和下調(diào)p53表達(dá)。該研究為視神經(jīng)損傷治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，但本研究內(nèi)容有限，還需更多的研究證實(shí)。