張憲波 劉月皎 錢世寧 董 杰

(江蘇省中醫(yī)院檢驗科，南京 210029)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性肺部傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2016年全球約有1 040萬例新發(fā)結(jié)核病患者，167萬例死于結(jié)核病。中國是全球20個結(jié)核病高負擔(dān)國家之一，發(fā)病例數(shù)78萬，居世界第2位，僅次于印度[1,2]。目前以痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性是臨床上診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準，由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢且培養(yǎng)耗時長，不利于早期診斷、治療肺結(jié)核患者[3]。當(dāng)前檢驗方法主要為微生物學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查，但這些診斷方法仍存在很多缺點，如敏感性低、檢出率低等，無法滿足臨床上的實際需求[4-6]。因此尋找簡單便捷的診斷方法具有重要意義。

CD44是廣泛表達于細胞膜上的跨膜蛋白多糖分子，屬于白細胞黏附分子(Leukocyte adhesion molecules，LAM)。已有研究發(fā)現(xiàn)CD44能夠促進巨噬細胞、T細胞活化及T、B細胞分化，廣泛參與炎癥反應(yīng)[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核桿菌感染的小鼠肺部有大量高表達CD44的T細胞聚集，提示CD44可能參與了該病原菌與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用[9,10]。CD44缺陷的小鼠在被結(jié)核桿菌感染后，在感染部位招募的單核巨噬細胞和T淋巴細胞數(shù)目減少，從而導(dǎo)致對TB的抵抗力下降[11]。進一步的研究顯示，結(jié)核桿菌菌株或其抗原能夠引起CD44表達上調(diào)，說明CD44在宿主抵抗其感染中可能扮演的重要角色[12-14]。但目前結(jié)核分枝桿菌是如何引起CD44的表達，以及CD44是通過何種機制發(fā)揮作用仍然不明確。因此，本研究采用qPCR、ELISA檢測CD44的表達情況，進一步探討CD44在肺結(jié)核患者體內(nèi)表達異常的作用機制，闡明CD44在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中所起的作用，探討其在肺結(jié)核診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人單核細胞THP-1購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.1.2試劑 CD44分子試劑盒(anti-human CD444)(eBioscience)；淋巴細胞分離液(Axis-Shield)；PAXgene Blood RNA Kit、Qiagene Rneasey Mini Kit(Qiagen)；CD44、CCL-2 ELISA試劑盒(R&D)；溶血素(BD)；ACK-buffer(北京賽馳生物科技)。

1.1.3儀器 生物安全柜(Thermo)；微量離心機(Beckman)；移液器(Eppendorf)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；低溫離心機(Millipore)；-80℃超低溫冰箱(中科美菱)；恒溫水浴鍋(江蘇國宇儀器)；熒光定量PCR儀(ABI)；酶標(biāo)儀(PerkinElmer)。

1.1.4研究對象 選取本院2015年6月～2016年12月疑診為肺結(jié)核患者236例，男性153例，女性83例，年齡18～69歲，平均(32.19±12.47)歲。根據(jù)2001年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[15]和肺結(jié)核的診斷標(biāo)準[16]：痰培養(yǎng)陽性、病理活檢肉芽腫性炎癥或干酪樣壞死、痰涂片陽性及抗酸染色陽性。上述患者分為肺結(jié)核患者組和肺結(jié)核患者組。其中結(jié)核患者組152例，男性96例，女性56例，年齡22～65歲，平均(36.78±10.21)歲。非肺結(jié)核患者84例，其中肺癌患者37例，男性21例，女性16例，年齡18～67歲，平均(42.78±13.19)歲；肺炎患者47例，男性32例，女性15例，年齡25～69歲，平均(35.76±8.37)歲。隨機選取健康體檢者100名作為對照組，男性50例，女性50例，年齡18～69歲，平均(33.54±13.29)歲。

1.2方法

1.2.1外周血PBMC分離 用抗凝管(肝素鋰或EDTA)采靜脈血5～10 ml，取15 ml離心管加入細胞分離液(Ficoll)5 ml，血標(biāo)本與血液量相等的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)混勻，將混有的PBS血液輕輕裝入管中，保持清楚的液面界限，離心(2 000 r/min，20 min)，滴管吸出中間細胞層PBMC，置于新的標(biāo)記好的無菌15 ml離心管中，離心后，棄上清，加入含1640培養(yǎng)基5 ml重懸細胞。

1.2.2T-spot.TB檢測 T-spot.TB檢測試劑盒由英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)，嚴格遵守說明書操作。結(jié)果判定：①陰性對照孔點數(shù)為0～5，檢測孔抗原A或B點數(shù)減去陰性對照孔點數(shù)6，陽性；②陰性對照孔點數(shù)為6，檢測孔抗原A或B點數(shù)2倍陰性對照孔點數(shù)，陽性。

1.2.3ELISA 用50 mmol/L的碳酸鹽包被緩沖液(pH9.6)溶解抗原，使抗原濃度為10～20 μg/ml，加100 μl/孔到96孔酶標(biāo)板，4℃放置過夜。第二天棄去包被液后，用PBST洗滌3次，每次5 min；每孔加入200 μl 1%的BSA，封阻1 h，PBST洗滌3次。每孔加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 h；用PBST洗滌3次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，在各孔中加入OPD底物顯色液，100 μl/孔，37℃孵育；每孔加入50 μl 2 mol/L的硫酸終止液終止反應(yīng)；于490 nm波長下測各孔的吸光值。

1.2.4RT-PCR法 提取全血及PBMC RNA，用分光光度計測定總RNA濃度，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。各指標(biāo)引物序列如下：CD44：5′-ACAACTGGTGATGGAGACTCATCC-3′(Forward)；5′-CAGAGTGGCTTATCATCTTGG-3′(Reverse)；CCL-2：5′-CTTCTGTGCCTGCTGCTC-3′(Forward)；5′-TGCTGCTGGTGATTCTTCT-3(Reverse)；GADPH：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

Real-time PCR 20 μl反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μl，上下引物各0.4 μl，DNA模板1 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，DEPC水7.8 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃ 15 s，60℃ 35 s，擴增40個循環(huán)；72℃ 5 min，讀取溶解曲線；60℃ 35 s 讀取熒光。結(jié)果以CT值表示?；虮磉_量以各樣基因CT值減去內(nèi)參基因GAPDH CT值表示，相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5病人隨訪 通過電話、門診及入院復(fù)查等隨訪方式對部分活動性結(jié)核患者隨訪至少9個月。

1.2.6細胞培養(yǎng)和分化 THP-1細胞培養(yǎng)：RPMI1640培養(yǎng)基(100 mg/L鏈霉素、100 U/L青霉素)在37℃、5%CO2及100%飽和濕度條件下培養(yǎng)THP-1細胞。

THP-1細胞分化：將懸浮的THP-1培養(yǎng)于含10% Fetal calf serum(FBS)的RPMI1640中，37℃、5% CO2，加入終濃度20 ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)，培養(yǎng)過夜，將其分化成巨噬細胞。

1.2.7結(jié)核桿菌感染菌落計數(shù)(CFU) 以MOI為5的H37Ra感染THP-1巨噬細胞，加入10 ng/ml的CD44，空白組不加，4 h后，PBS洗去上清中的細菌，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。吸去上清，加入0.7%的SDS溶液裂解細胞，梯度稀釋后，取50 μl涂板。平板培養(yǎng)皿用封口膜密封，倒置放在5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3周。3周后取出平板，計數(shù)結(jié)核桿菌菌落，計數(shù)CFU值。

1.2.8分離胸水灌洗液細胞 收集過濾后的胸水25 ml，25℃，2 000 r/min，離心5 min，收集上清，沉淀用ACK-buffer 5 ml加入紅細胞裂解液，混勻，2 min，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞，離心收集細胞備用。

1.2.9巨噬細胞刺激實驗 THP-1誘導(dǎo)分化的巨噬細胞于6孔板中，以1.5 ml RPMI1640培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)。實驗組加入0.5 ml相應(yīng)胸水，或同時加入不同劑量(10、20、40 ng/ml)的TNF-α中和性抗體。另一實驗中加入終濃度為10 ng/ml的TNF-α。24 h后收集上清液進行ELISA檢測。結(jié)核桿菌感染實驗中，MOI為5的H37Ra感染THP-1巨噬細胞，或同時加入不同劑量(10、20、40 ng/ml)的TNF-α中和性抗體，并以單獨加入終濃度為10 ng/ml 的TNF-α作為對比。

2 結(jié)果

2.1各組受試者CD44水平和T-spot.TB檢測 利用熒光定量PCR檢測各個組別人群外周血PBMC中CD44的表達水平，結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者中CD44的表達水平顯著高于非肺結(jié)核患者組和健康對照組(P<0.01)(圖1A)。

進一步我們利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測了各個組別人群血漿中CD44的濃度，結(jié)果顯示，在肺結(jié)核患者的血漿中，游離CD44的濃度為(5.896±0.387)ng/ml顯著高于非結(jié)核患者[(0.517±0.139)ng/ml]和健康對照組[(0.523±0.614)ng/ml](P<0.05)，肺結(jié)核患者組T-sport.TB陽性例數(shù)多于非肺結(jié)核患者組和健康對照組，見表1。

2.2肺結(jié)核患者體內(nèi)CD44的表達水平隨著抗結(jié)核治療逐步降低 為了進一步研究CD44在肺結(jié)核患者療效評估中的作用，對部分肺結(jié)核患者進行了隨訪，在治療后不同時間點(3、6、9月)抽取血標(biāo)本，qRT-PCR檢測外周血PBMC中CD44的mRNA水平以及血漿中游離CD44濃度的變化情況。結(jié)果顯示，在抗結(jié)核治療后，外周血中CD44 mRNA表達水平顯著降低，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。除此之外，血漿中游離CD44的濃度從治療前的(5.896±0.387)ng/ml，到治療后分別降到(4.126±0.197)ng/ml、(2.275±0.217)ng/ml和(1.031±0.429)ng/ml，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。以上結(jié)果表明，隨著抗結(jié)核治療的推進，CD44的表達水平逐漸降低，結(jié)核病情逐步好轉(zhuǎn)，因此，CD44可作為輔助評估結(jié)核治療是否有效的指標(biāo)。

表1 各個組別人群血漿CD44水平及T-spot.TB檢測結(jié)果

Note：1)P<0.05 compared with Healthy control group;2)P<0.05 compared with non-tuberculosis group.

2.3CD44對巨噬細胞清除結(jié)核桿菌能力的影響 為了研究CD44對巨噬細胞的殺菌能力的影響。在結(jié)核桿菌感染的巨噬細胞中加入CD44，處理72 h后裂解細胞涂板，3周后計算CFU。結(jié)果顯示(圖3A)，在培養(yǎng)體系中加入CD44的巨噬細胞中結(jié)核桿菌的載量與對照組沒有顯著性差異，表明CD44對巨噬細胞清除結(jié)核桿菌的能力沒有影響。

趨化因子CCL2與免疫細胞的定向遷移密切相關(guān)[17-19]，為了驗證CD44能否作用CCL2，我們檢測了對照組、H37Ra處理組、CD44處理組以及H37Ra+CD44a處理組巨噬細胞中細胞因子的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)，CD44對巨噬細胞中CCL2的表達水平無明顯作用，H37Ra+CD44a處理后可顯著提高巨噬細胞中CCL2的表達水平(圖3B和表3)，表明CD44協(xié)同結(jié)核桿菌誘導(dǎo)巨噬細胞分泌CCL2，從而促進細胞的遷移。

2.4TNF-α誘導(dǎo)巨噬細胞中CD44的表達 為了進一步探索CD44升高的機制，我們檢測了肺結(jié)核性胸膜炎患者胸水上清中CD44、IL-10、TNF-α的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD44和TNF-α在肺結(jié)核患者中的表達水平顯著高于非結(jié)核患者和健康對照組(圖4A和表4)。另外，我們在體外巨噬細胞系中分別加入結(jié)核性胸膜炎患者與非結(jié)核性胸膜炎患者胸水，結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜炎患者胸水上清作用后細胞的中IL-10水平與非結(jié)核性胸膜炎患者胸水上清作用后的細胞相比，差異不大(P>0.05)，但CD44和TNF-α的水平顯著升高(P<0.05)(圖4B和表5)?；诖耍覀兺茰yCD44的表達和TNF-α有一定的關(guān)系。

為了進一步明確TNF-α對CD44 表達的作用，在結(jié)核性胸膜炎患者胸水上清刺激THP-1分化的巨噬細胞，同時加入不同濃度TNF-α中和抗體，或以功能性TNF-α蛋白單獨刺激巨噬細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入TNF-α中和抗體后，CD44的表達水平顯著降低(P<0.05)，單獨加入功能性TNF-α蛋白后，CD44水平顯著增加(表6)。以上結(jié)果表明，TNF-α的產(chǎn)生可能是引起CD44表達的重要原因。進一步我們用結(jié)核分枝桿菌菌株H37Ra刺激巨噬細胞，同時給予不同濃度的TNF-α中和抗體，分析巨噬細胞中CD44的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，H37Ra感染巨噬細胞能夠引起CD44的表達上調(diào)，20 ng/ml和40 ng/ml的TNF-α中和抗體能夠阻止CD44的上調(diào)。以上結(jié)果均提示，結(jié)核患者體內(nèi)CD44的表達增高可能是由于結(jié)核患者中高表達的TNF-α，從而刺激巨噬細胞產(chǎn)生CD44，但其具體機制還有待進一步探討。

圖1 qRT-PCR檢測CD44在不同人群的外周血PBMC中的表達水平Fig.1 Expression level of CD44 in different populations in PBMC extracted from peripheral bloodNote: *.P<0.05，compared with Healthy control group;#.P<0.05，compared with non-tuberculosis group.

表2 肺結(jié)核組治療前后血漿CD44的水平

Note：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001，compared with pre-before treatment.

表3 CD44促進結(jié)核桿菌感染的巨噬細胞表達趨化因子CCL-2

Note：1)P<0.01,2)P<0.001，compared with mock.

圖2 qRT-PCR檢測肺結(jié)核組治療前后外周血PBMC中CD44 mRNA的水平Fig.2 Dynamic changes of CD44 mRNA before and after treatment in PBMC extracted from peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients were examined by qRT-PCRNote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001 compared with pre-treatment.

表4 胸水上清中細胞因子的表達

Note：1)P<0.05,2)P<0.01 compared with Healthy control group;3)P<0.05 compared with non-tuberculosis group.

圖3 CD44對巨噬細胞清除結(jié)核桿菌能力和遷移能力的影響Fig.3 Effects of CD44 on ability of removing M.tuberculosis and mobility of macrophage cellsNote: A.Cells infected with M.tuberculosis.Two groups of cells are incubation with H37Ra of M.tuberculosis,another group of cells were incubated with extra CD44；B.The expression of chemokine CCL-2 in macrophages infected with M.tuberculosis was promoted by CD44.(**.P<0.01,***.P<0.001 compared with mock.)

表5 巨噬細胞加入結(jié)核性胸膜炎和肺炎患者的胸水24 h后細胞因子的表達

Note：1)P<0.05,2)P<0.01compared with Healthy control group;3)P<0.05 compared with non-tuberculosis group.

表6 TNF-α中和抗體抑制結(jié)核患者胸水刺激的巨噬細胞CD44的表達

Note：1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001，compared with Mock;4)P<0.05,5)P<0.01，compared with hydrothorax only.

圖4 CD44、IL-10、TNF-α的表達Fig.4 Expression of CD44,IL-10 and TNF-αNote: A.The expression of cytokine in hydrothorax supernatant;B.Macrophages were incubated with pleural fluid of tuberculous pleurisy and non-tuberculosis patients 24 hours to detect the expression of cytokines(*.P<0.05,**.P<0.01 compared with Healthy control group;#.P<0.05 compared with non-tuberculosis group);C.TNF-α neutralizing antibody,added into the macrophages,neutralized the expression of TNF-α,and functional TNF-α induced the expression of TNF-α(*.P< 0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 compared with Mock;#.P<0.05,##.P<0.01 compared with hydrothorax only).

3 討論

細胞黏附分子(Cell adhesion molecules，CAM)是一類介導(dǎo)細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)之間黏附及相互作用的細胞表面跨膜糖蛋白，能夠參與細胞黏附、遷移、分化等過程，在炎癥、免疫等反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用[20]。

CD44屬于白細胞表面黏附分子，可促進巨噬細胞活化，促進T、B細胞分化以及T細胞活化，廣泛參與機體炎癥反應(yīng)[21-23]。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者外周血CD44 mRNA水平較正常人明顯增高，ELISA結(jié)果同樣表明了肺結(jié)核患者血漿游離CD44顯著高于正常人，在3、6、9個月治療后，CD44水平明顯降低，但仍高于正常人；表明CD44可能參與了肺結(jié)核病的保護機制。

為了驗證CD44是否在肺結(jié)核患者特異高表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者CD44的表達顯著高于非結(jié)核肺部疾病組，表明CD44的表達增高具有一定的特異性。除此之外還發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎患者胸水中CD44也顯著高于非結(jié)核肺部疾病患者，進一步證實了CD44的表達增高具有一定的疾病特異性。為排除年齡、性別等因素對檢測結(jié)果的影響，我們對不同年齡、性別的CD44的水平進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同的年齡、性別之間CD44的水平無明顯差異，表明CD44與性別、年齡無關(guān)。但是有文獻報道，CD44在惡性腫瘤患者的胸腔積液中高水平表達，可能與腫瘤誘發(fā)的免疫應(yīng)答有關(guān)[24,25]。因此CD44作為輔助診斷結(jié)核胸膜炎的檢測指標(biāo)特異性一般，可考慮與腺苷脫氨酶一起檢測，以提供更有價值的參考信息。然而本研究發(fā)現(xiàn)CD44可以隨著治療后病人的好轉(zhuǎn)而下降，因此可以作為療效監(jiān)測和評估復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。

趨化因子及其受體對細胞的遷移有著重要的作用[26,27]。CCL2對介導(dǎo)單核細胞和巨噬細胞的遷移具有重要的作用[28-30]。研究表明CD44對巨噬細胞清除結(jié)核桿菌的能力沒有影響，且不能直接作用巨噬細胞分泌CCL2，但能夠協(xié)同結(jié)核桿菌誘導(dǎo)巨噬細胞分泌CCL2，從而促進細胞的遷移。說明機體在正常免疫穩(wěn)態(tài)下，不需要CD44的參與，但當(dāng)結(jié)核桿菌引起的炎癥狀態(tài)下，CD44可反應(yīng)性升高，促進先天性免疫細胞向炎癥遷移，發(fā)揮免疫放大效應(yīng)。

在該研究中，對肺結(jié)核患者CD44表達增高機制進行了初步的探索，發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌可能通過調(diào)節(jié)T細胞產(chǎn)生TNF-α，進而誘導(dǎo)CD44的表達，TNF-α是CD44表達的強烈誘導(dǎo)劑[31,32]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)核患者中TNF-α含量顯著高于肺結(jié)核患者。我們利用結(jié)核性胸膜炎患者和肺結(jié)核性胸膜炎患者胸水上清作用于巨噬細胞。發(fā)現(xiàn)加入結(jié)核性胸膜炎患者胸水上清后，CD44的表達顯著升高。我們利用TNF-α中和抗體后，CD44表達顯著下降。為進一步驗證TNF-α的作用，直接加入功能性TNF-α，CD44的表達顯著增加，表明TNF-α能夠誘導(dǎo)巨噬細胞CD44的表達。據(jù)文獻報道，TNF-α可通過p38MAPK途徑調(diào)控腫瘤細胞的CD44高表達，從而促進腫瘤細胞的遷移[33]。而在巨噬細胞中，TNF-α是否通過類似的機制發(fā)揮作用，仍需要進一步實驗證明。而治療后CD44下降，可能是由于結(jié)核菌載量下降，因而引發(fā)的炎癥應(yīng)答下降，TNF-α產(chǎn)生水平下降，因此導(dǎo)致了CD44水平下降。

T-spot.TB是近些年實驗室診斷肺結(jié)核的有效手段之一[34,35]，其是干擾素釋放試驗(Interferon gamma release assay，IGRA)的一種檢測技術(shù)[36-38]。該試驗是用結(jié)核桿菌的保守區(qū)域的截短抗原肽，對淋巴細胞進行刺激，當(dāng)近期有結(jié)核感染時，體內(nèi)存在能夠識別結(jié)核桿菌抗原的效應(yīng)T細胞，在截短抗原肽的刺激下能夠被激活釋放大量的IFN-γ，并進一步檢測釋放IFN-γ的細胞數(shù)量。因為只有效應(yīng)T細胞會被激活，而效應(yīng)T細胞半衰期相對較短，所以當(dāng)試驗發(fā)現(xiàn)大量被激活的T細胞，能夠在一定程度上反映機體近期有活動性結(jié)核感染。本實驗研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者組T-sport.TB陽性例數(shù)多于非肺結(jié)核患者組和健康對照組，但對結(jié)核病患者進行血清CD44水平與T-spot.TB聯(lián)合檢測還需進一步研究。

綜上所述，CD44在肺結(jié)核患者外周血和胸水中表達增高，并且隨著抗結(jié)核的治療，CD44表達逐漸降低；CD44能夠協(xié)同結(jié)核桿菌促進巨噬細胞分泌CCL2，促進細胞遷移；TNF-α能夠誘導(dǎo)巨噬細胞中CD44的表達，但具體機制還需進一步探索。