史光華 李麟輝 呂龍寶 張曉迪 陳佳琦

(1. 中國合格評定國家認(rèn)可中心，北京 100062)(2. 中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明 650223)

體現(xiàn)“替代、減少、優(yōu)化”的3R準(zhǔn)則是當(dāng)今國際上開展動物試驗普遍遵循的動物福利原則[1]?！疤娲瓌t”指使用其他方法而不用動物進(jìn)行科學(xué)研究，或使用沒有知覺的試驗材料替代以往使用神志清醒、活的脊椎動物進(jìn)行試驗；“減少原則”指減少動物用量獲取同樣多的試驗數(shù)據(jù)或使用一定數(shù)量的動物獲得更多試驗數(shù)據(jù)的方法；“優(yōu)化原則”指通過改進(jìn)或完善實驗程序，減輕或減少給動物造成與實驗?zāi)康臒o關(guān)的疼痛和不安[1-2]。目前，“優(yōu)化”原則主要體現(xiàn)在應(yīng)用仁慈終點(diǎn)并仁慈處死動物(即安樂死)[3]。因此，國際上將仁慈終點(diǎn)及安樂死作為一種優(yōu)化策略，用來減輕動物在實驗期間遭受的疼痛和痛苦[4]。

實際工作中如何正確實施仁慈終點(diǎn)及安樂死是實現(xiàn)“優(yōu)化”原則的重要步驟。本文主要介紹國際上實驗動物仁慈終點(diǎn)及仁慈處死動物的相關(guān)指南、法規(guī)實踐現(xiàn)狀，為業(yè)界同仁及我國相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 國際及區(qū)域組織

1.1 經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織

經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for economic co-operation and development, OECD)于2000年發(fā)布的《應(yīng)用臨床體征識別、評估安全性評價中動物實驗仁慈終點(diǎn)的指南》(以下簡稱指南)適用于所有毒理學(xué)動物試驗中使用的哺乳動物。指南詳細(xì)敘述了識別動物疼痛和痛苦的方法、仁慈處死動物需要依據(jù)的毒性表現(xiàn)及仁慈處死動物的方法[5]。優(yōu)化原則在該文件中得到了明確且充分的體現(xiàn)，在國際范圍內(nèi)具有至高的權(quán)威性[3]。

《指南》提出：仁慈處死動物需要根據(jù)動物正在承受疼痛和痛苦的程度來決定。觀察者應(yīng)熟悉動物正常和異常表現(xiàn)，要有能力來識別動物的毒性表現(xiàn)。對試驗中的動物每天進(jìn)行一次一般觀察，至少一周一次進(jìn)行詳細(xì)檢查，出現(xiàn)毒性表現(xiàn)后可增加觀察次數(shù)?！吨改稀分袑游锸欠裨诔惺芴弁春屯纯嗟挠^察指標(biāo)及動物正在承受疼痛和痛苦的表現(xiàn)進(jìn)行了詳細(xì)說明。瀕死和臨近死亡的動物和正在遭受嚴(yán)重疼痛和痛苦的動物應(yīng)進(jìn)行安樂死。急性毒性試驗中動物健康產(chǎn)生快速改變、重復(fù)染毒試驗中動物毒性表現(xiàn)進(jìn)行性加重時均應(yīng)考慮是否對動物進(jìn)行安樂死。

仁慈處死動物的方法即安樂死，是指處死動物時盡可能減少動物的疼痛和痛苦。《指南》主要介紹了物理學(xué)方法、注射法、吸入法、混合法等。物理學(xué)方法需要較高的技術(shù)熟練程度，魚類和兩棲類動物處死時一般選擇物理方法，體質(zhì)量小于150 g的嚙齒類動物可采用頸椎脫臼法；犬、貓、豬、猴等大型動物處死時一般選擇注射法；大鼠、小鼠和其他小型嚙齒類動物一般選擇二氧化碳吸入法。

1.2 歐盟

1.2.1ETS 123：歐盟《用于實驗及其他科學(xué)目的的脊椎動物保護(hù)歐洲公約》(European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes)第5款的補(bǔ)充說明(Appendix A- Guidelines for accomodation and care of animals)，對動物的安樂死提出了要求：所有處死動物的人道方法均需要有一定專業(yè)技能的人員施行，而這些專業(yè)技能只能通過適當(dāng)培訓(xùn)獲得。處死動物所采用的方法宜遵循歐洲委員會關(guān)于實驗動物施行安死術(shù)推薦意見中規(guī)定的原則(第1部分和第2部分)。深度昏迷的動物可采用放血法處死，但在未實施麻醉的情況下，不宜使用在失去知覺前造成肌肉麻痹的藥物方法、產(chǎn)生箭毒樣作用的藥物方法，以及電流不通過大腦的電擊法。動物處置只有在確認(rèn)動物死亡后才可施行。

1.2.2歐盟2010/63/EU：歐盟27國于2013年1月1日起實施新的保護(hù)試驗用動物指令，該法規(guī)承認(rèn)目前仍需要使用動物進(jìn)行試驗的現(xiàn)狀，并把仁慈終點(diǎn)提上了法律層面。新指令第1條就明確了3R原則，指出應(yīng)確保優(yōu)化的原則并不局限于指導(dǎo)科學(xué)實驗，還應(yīng)運(yùn)用于動物的照料、護(hù)理、飲食和繁殖過程[6]。

指令禁止動物遭受非常嚴(yán)重的疼痛和痛苦，在條款23第13條中規(guī)定“盡可能避免以死亡作為試驗終點(diǎn)，以更早期和仁慈的終點(diǎn)取代”，第15條規(guī)定“如果涉及到可能是長期的而不能緩解的劇烈疼痛、痛苦或不適，成員國應(yīng)確保該項目不被執(zhí)行”，并在附件八中列出了試驗程序中動物痛苦嚴(yán)重程度分類。第6條規(guī)定了強(qiáng)制性人道處死動物的內(nèi)容，并在附件四中列出了不同實驗動物進(jìn)行仁慈處死的具體指南[7]。

2 其他國家

2.1 美國

美國國家科學(xué)院發(fā)布的《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》對動物仁慈終點(diǎn)判定及安樂死的時機(jī)、方法選擇、評價都做了詳細(xì)介紹。明確指出在某些實驗臨近實驗終點(diǎn)時，若動物即將遭受無法減輕的劇痛和不適、甚至是死亡時，可采用仁慈終點(diǎn)代替實驗終點(diǎn)[8]。

仁慈終點(diǎn)的判定需要衡量模型、動物種類、動物健康狀況、實驗?zāi)康?、機(jī)構(gòu)政策和法規(guī)要求等多種要素。實驗動物管理和使用人員應(yīng)該熟悉動物的行為、生理、生化方面的健康特征，才可辨識不同動物對疼痛的臨床癥狀，如悲鳴、消沉、行為異常、外貌動作異常、懶怠不動等。通常情況下認(rèn)為引起人類疼痛的手術(shù)也會引起動物疼痛。

實驗方案中應(yīng)該包括執(zhí)行安樂死的標(biāo)準(zhǔn)，比如身體或行為缺陷等級、腫瘤大小等。當(dāng)實驗結(jié)束，鎮(zhèn)靜劑、止痛劑及其他方法無法減輕實驗動物疼痛憂慮時，才能進(jìn)行安樂死。執(zhí)行安樂死時藥劑和方法的選擇取決于動物種類和實驗?zāi)康?。一般來說，吸入性或非吸入性安樂死藥劑優(yōu)于物理安樂死(如頸椎脫臼法、斬首、穿透式擊桿法)。評價安樂死方法是否妥當(dāng)，應(yīng)該考慮幾方面：使動物在無痛苦、無焦慮或短暫痛苦的狀態(tài)下失去意識或死亡的能力；可靠性；不可逆性；引導(dǎo)動物喪失意識的時間；種類和年齡限制；與研究目標(biāo)一致性；工作人員的安全以及對他們情緒的影響。

2.2 加拿大

1998年加拿大動物保護(hù)協(xié)會(CCAC)發(fā)布了《研究、教學(xué)和檢測中選擇實驗動物仁慈終點(diǎn)指南》，為用于生物醫(yī)學(xué)研究、教學(xué)及試驗中動物疼痛及痛苦終點(diǎn)的選擇進(jìn)行規(guī)范，并指出動物使用的優(yōu)化是一個漸進(jìn)過程，需要不斷尋找更為人道的動物實驗終點(diǎn)將動物使用過程中其經(jīng)歷的痛苦最小化[9]。

指南主要對如何確定仁慈終點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)介紹，并對嚙齒類動物單克隆抗體制備、癌癥研究、毒理學(xué)研究和毒性測試、疼痛研究、傳染病研究、疫苗試驗等研究中仁慈終點(diǎn)的確定給予指導(dǎo)意見。指南給出了選擇合適仁慈終點(diǎn)的推薦程序：使用評分法對動物身體狀況進(jìn)行評估，所得分?jǐn)?shù)意味著動物偏離正常狀態(tài)的程度，可看作為是動物疼痛和痛苦的增加。

試驗過程中的動物會隨著不適、疼痛和痛苦的程度表現(xiàn)出異常，因此在實驗前應(yīng)熟知動物的行為特性。根據(jù)研究內(nèi)容制定觀察指標(biāo)對動物狀況進(jìn)行評分可為仁慈終點(diǎn)的判定提供客觀參考，以此來建立動物疼痛評估方法。評估動物身體狀況主要有五個方面，分別為體質(zhì)量變化、外部體征表現(xiàn)、心率和呼吸頻率等臨床指標(biāo)、非誘導(dǎo)行為的變化及外部刺激的行為反應(yīng)。除這些行為和生理指標(biāo)外，兒茶酚胺、皮質(zhì)激素、催乳素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等血液生化指標(biāo)也可用來衡量動物的壓力和痛苦。確定觀測指標(biāo)后，對部分重要指標(biāo)還需要進(jìn)行選擇和優(yōu)化。例如當(dāng)某種特殊疾病或在有毒情況下動物狀況發(fā)生惡化時，低溫也可能成為動物情況惡化的重要指標(biāo)：流感病毒感染小鼠體溫的降低(低于32 ℃)預(yù)示著它們的死亡；細(xì)菌感染的小鼠體溫低于34 ℃的低溫預(yù)示著死亡。在大鼠關(guān)節(jié)炎模型中，抓撓次數(shù)的增加是關(guān)節(jié)炎發(fā)展最顯著的行為改變，表明其存在慢性疼痛。在一些醫(yī)學(xué)試驗中，當(dāng)不明確動物對處理產(chǎn)生的效應(yīng)時，使用少數(shù)動物進(jìn)行預(yù)實驗來確定動物表現(xiàn)，有助于確定觀測指標(biāo)及頻率。

3 中國

動物福利的3R原則首次出現(xiàn)在1997年《關(guān)于“九五”期間實驗動物發(fā)展的若干指導(dǎo)意見》中[10]。為適應(yīng)國際上動物福利的發(fā)展趨勢，2006年科技部發(fā)布了《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，明確指出“善待實驗動物”就是倡導(dǎo)3R原則。

國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27416—2014)《實驗動物機(jī)構(gòu)質(zhì)量和能力的通用要求》第七章中，有5個條款和6個條款對安樂死術(shù)和人道終點(diǎn)的實施提出了要求。強(qiáng)化了實驗動物人道終點(diǎn)和安樂死術(shù)的重要性，在組織機(jī)構(gòu)設(shè)置、工作內(nèi)容安排、工作程序運(yùn)作、基本原則的把握等方面為實驗動物機(jī)構(gòu)的良好運(yùn)作提供了制度上的保證。相對而言，該標(biāo)準(zhǔn)提出的要求還是概略性的、原則性的，內(nèi)容還不夠具體細(xì)化，對于評價的內(nèi)容以及如何評價沒有做出具體的規(guī)定和建議。對于實際工作中遇到的具體問題難以給出具體的指導(dǎo)，在很大程度上還需要依靠人為裁定，不利于管理實施。若要對具體的實驗動物福利工作進(jìn)行指導(dǎo)，這兩部分內(nèi)容需要進(jìn)一步的細(xì)化和完善，以利于實際工作的開展和持續(xù)評估。

4 展望

西方發(fā)達(dá)國家在實驗動物仁慈終點(diǎn)及安樂死的實施方面已經(jīng)建立了完整的理論體系，與其相比，我國在法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)體系建立方面還處于起步階段，需要盡快補(bǔ)充和完善。

當(dāng)前我國實驗動物服務(wù)業(yè)正在快速融入全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展的步伐中，動物福利相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)都應(yīng)盡快完善，建立符合國際規(guī)范的動物福利審查、實施、評價制度。同國外相關(guān)人道處死動物的法律法規(guī)相比，現(xiàn)階段我國在實驗動物安樂死依據(jù)及方法相關(guān)內(nèi)容的起草處于起步階段。應(yīng)借鑒其他國家的制定內(nèi)容，細(xì)化相關(guān)條文并加強(qiáng)可操作性，為解決實際工作中的問題提供指導(dǎo)。

值得注意的是，實驗動物福利相關(guān)法律是一把雙刃劍，完備的法律法規(guī)可以增強(qiáng)我國實驗動物產(chǎn)品在國際貿(mào)易中的競爭力，反之則會增加不必要的負(fù)擔(dān)[11]。因此制訂工作必須根據(jù)我國生物醫(yī)學(xué)研究方面的國情因地制宜。完善的法規(guī)內(nèi)容將有助于實驗動物福利工作的開展和評估，對于加強(qiáng)我國實驗動物的福利管理具有重要的意義；有助于提高認(rèn)可結(jié)果的公信力，促進(jìn)政府部門對認(rèn)可結(jié)果的采信；加快實驗動物機(jī)構(gòu)認(rèn)可制度認(rèn)可結(jié)果的國家間互認(rèn)，繼而實現(xiàn)國際間互認(rèn)的步伐；突破實驗動物相關(guān)技術(shù)性國際貿(mào)易壁壘，加快實驗動物相關(guān)科研和產(chǎn)業(yè)的國際化交流和發(fā)展。