魏 敏，牛 妞，蔣琪霞

慢性傷口是指經(jīng)過6周臨床治療后，仍無法及時(shí)有效地按正常程序愈合的傷口，主要包括壓瘡、糖尿病足潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍及下肢動(dòng)靜脈潰瘍，此類傷口病程遷延[1-2]。研究證實(shí)細(xì)菌生物膜是影響慢性傷口持久不愈的重要原因[2]。如何快速準(zhǔn)確識(shí)別生物膜及其病原菌是臨床有效干預(yù)的前提。筆者就慢性傷口生物膜的概念及分布、臨床識(shí)別方法、臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)、常用實(shí)驗(yàn)室診斷方法作如下綜述。

1 生物膜的概念及分布

生物膜是細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境的變化而群居并吸附于傷口表面，產(chǎn)生富含多糖、蛋白質(zhì)、DNA、脂類和水等物質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular polymeric substances,EPS)，并形成具有立體結(jié)構(gòu)的膜樣復(fù)合物[3]。傷口細(xì)菌形成的生物膜將菌體層層包裹，阻止或延緩抗生素滲透而難以發(fā)揮抗菌作用并誘導(dǎo)細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性[4]，導(dǎo)致傷口難以愈合。

近年來已證實(shí)慢性傷口中普遍存在生物膜，且發(fā)生率逐年增加。早在2008年James等[5]發(fā)現(xiàn)60%的慢性傷口存在生物膜感染，近期研究顯示其在慢性傷口中發(fā)生率已達(dá)到75%～90%[3,6]，給治療帶來極大挑戰(zhàn)。然而，近年一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)急性傷口中生物膜感染也有增多趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)在5例足潰瘍的急性傷口中均存在生物膜[7]，而對比往期研究[6]急性傷口生物膜感染發(fā)生率僅為6%。Gurjala等[8]通過兔耳急性傷口模型發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在接種后24h內(nèi)形成生物膜，Tongtong等[9]研究顯示同樣在兔耳急性感染傷口中，金黃色葡萄球菌接種6h即迅速成長并建立成熟生物膜。以上研究均表明，傷口在細(xì)菌感染后24h內(nèi)即可完成生物膜自我繁殖過程，推測未來生物膜在急性傷口中的發(fā)生率也將增加。目前關(guān)于生物膜的識(shí)別仍沒有統(tǒng)一定論，臨床識(shí)別更加困難。如何早期識(shí)別診斷繼而實(shí)施針對清除生物膜的傷口管理策略，最終改善患者傷口預(yù)后尤為重要。

2 生物膜的臨床識(shí)別

2.1生物膜的臨床特點(diǎn) 經(jīng)大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，生物膜的臨床特點(diǎn)可總結(jié)為以下四點(diǎn)：(1)肉眼觀察生物膜呈薄層淡黃色半透明的膠狀物質(zhì)[7]。由于某些細(xì)菌增殖可導(dǎo)致色素分泌，其外觀顏色也會(huì)相應(yīng)改變，如臨床中最常見且最易形成生物膜的兩種細(xì)菌-金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，可分別產(chǎn)生葡萄球菌黃素和綠膿菌素，致使生物膜呈淡黃色和淡綠色[10-12]。這一特點(diǎn)是有效進(jìn)行臨床識(shí)別的第一步。(2)生物膜可存在于傷口表面及較深組織中。研究顯示生物膜不僅覆蓋在傷口表面，還常常隱藏于基底組織中(平均深度為50～70微米)[7]，且不同種類細(xì)菌生物膜定植的深度不同，如厭氧菌的深度顯著大于需氧菌。定植于傷口深部這一特點(diǎn)可能是導(dǎo)致傷口處于持續(xù)炎癥過程的重要因素[13]，給臨床肉眼識(shí)別帶來難度。(3)去除容易，但易快速重新形成。這是慢性傷口生物膜特異性的臨床特點(diǎn)。傷口表面的生物膜可通過諸如鑷子、保守性銳器等機(jī)械清創(chuàng)方法輕易去除，顯示出基底部新鮮的肉芽組織，但清創(chuàng)后，殘留在傷口中的游離細(xì)菌能夠在24h內(nèi)迅速重建生物膜[10]，以逃避宿主反應(yīng)和抗菌劑的作用。而重新形成的生物膜對抗菌劑的耐藥性增強(qiáng)，更加難以清除[7]。因此，清創(chuàng)后應(yīng)結(jié)合抗菌及抗生物膜敷料等有效處理，最大限度地減少殘留細(xì)菌重新形成生物膜的機(jī)會(huì)。 (4)與腐肉相鑒別。腐肉常常與生物膜同時(shí)覆蓋在傷口表面，可成為生物膜中細(xì)菌生長繁殖的培養(yǎng)基，臨床中易混淆[13]。兩者的臨床鑒別要點(diǎn)可歸納為三點(diǎn)[9-10，13]：①兩者性狀不同。腐肉常呈黃色松散狀，生物膜呈淡黃色半透明膠狀。②由于腐肉與其下面的傷口基底部組織緊密連接，不易經(jīng)機(jī)械清創(chuàng)去除，需銳器才能徹底去除。而生物膜可經(jīng)機(jī)械方法清除。③腐肉對酶類或自溶清創(chuàng)類敷料較生物膜敏感，效果更佳。了解生物膜的臨床特點(diǎn)及其鑒別診斷，有助于傷口專業(yè)人員快速有效臨床判斷生物膜的存在，及時(shí)給予相應(yīng)干預(yù)措施，以免延誤最佳治療時(shí)機(jī)。

2.2生物膜的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 目前，已有專家提出生物膜的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。2012年世界生物膜研討會(huì)初步總結(jié)了生物膜感染傷口的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：(1)蒼白水腫的傷口床；(2)脆弱的肉芽組織；(3)大量黃色滲液；(4)壞死腐爛組織；(5)傷口疼痛；(6)有腐臭味。2017年這一標(biāo)準(zhǔn)得以更新，生物膜感染共識(shí)指南[15]提出，傷口出現(xiàn)以下指征可能存在生物膜：(1)抗生素、抗菌劑治療無效；(2)傷口愈合延遲；(3)反復(fù)感染或惡化；(4)大量滲液；(5)輕度慢性炎癥；(6)輕度紅腫。由此得出，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中大量滲液是共有特征，是臨床識(shí)別的重要標(biāo)志。此外，Johani等[7]在65例糖尿病足潰瘍傷口的生物膜臨床研究中，通過與實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果進(jìn)行對比，證實(shí)了大量滲液是作為生物膜臨床識(shí)別的重要依據(jù)。依據(jù)臨床判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合生物膜的臨床特點(diǎn)，傷口專業(yè)人員可初步判斷傷口中的生物膜，但為了確認(rèn)判斷標(biāo)準(zhǔn)中每一條的科學(xué)性，未來應(yīng)基于隨機(jī)對照試驗(yàn)等高質(zhì)量研究進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

3 生物膜的實(shí)驗(yàn)室方法

由于生物膜引起的感染較為隱匿，無急性感染的典型表現(xiàn)(紅、腫、熱、痛)[16]，且可能位于傷口深層組織中，臨床難以用肉眼精確識(shí)別。進(jìn)一步診斷還需借助實(shí)驗(yàn)室工具，通過確認(rèn)生物膜中的細(xì)菌或細(xì)胞外基質(zhì)中的特異性成分準(zhǔn)確識(shí)別生物膜。

3.1識(shí)別生物膜中細(xì)菌 細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)被認(rèn)為是臨床上常用的識(shí)別致病菌的方法。傳統(tǒng)取樣方法為Z形拭子技術(shù)，即用生理鹽水將棉簽拭子打濕，旋轉(zhuǎn)并以“Z形”鋸齒狀從傷口一邊到另一邊進(jìn)行擦拭取樣[17]。研究顯示由于細(xì)菌定植部位的隱蔽性，大量厭氧菌隱藏在傷口深部，此種拭子技術(shù)不能充分觸及傷口基底，因此常常低估慢性傷口中厭氧菌的存在[18]。

Copeland-Halperin等[19]證實(shí)，與Z技術(shù)相比，通過Levine技術(shù)診斷慢性傷口感染的準(zhǔn)確性、靈敏度及特異性更高。具體方法為：將無菌棉簽在傷口床的1cm2區(qū)域內(nèi)旋轉(zhuǎn)5s，同時(shí)施加輕微的壓力，擠出傷口基底部的滲液，收集定植在深部的致病菌。Haalboom等[20]臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在180名患者傷口中使用Levine技術(shù)進(jìn)行傷口細(xì)菌取樣的培養(yǎng)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)-活組織檢查的結(jié)果類似，結(jié)果一致性達(dá)到84.4%～99.4%。

與活組織檢查相比，拭子技術(shù)無侵入性、不增加患者痛苦、操作簡單的特點(diǎn)更易被患者及醫(yī)務(wù)人員接受，Levine技術(shù)值得臨床推薦使用。為進(jìn)一步提高生物膜感染傷口內(nèi)細(xì)菌檢出的準(zhǔn)確性，近年發(fā)展出一些新的檢測手段，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、肽核酸熒光原位雜交技術(shù)(PNA-FISH)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、16S脫氧核糖核苷酸測序技術(shù)(16S rRNA)[16,21]等分子生物技術(shù)。但由于其操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴，難以在臨床廣泛推廣。

3.2識(shí)別生物膜中細(xì)胞外基質(zhì) 識(shí)別生物膜的實(shí)驗(yàn)室方法包括掃描電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、聚合酶鏈反應(yīng)與熒光原位雜交等，其中前兩種最為常用。歐洲臨床微生物學(xué)生物膜研究組指出，使用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡能提高生物膜實(shí)驗(yàn)診斷的陽性率[22]。

3.2.1掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡(簡稱"掃描電鏡")可在樣品表面掃描激發(fā)出電子而成像, 圖像有很強(qiáng)的立體感, 可用來觀察生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察慢性傷口生物膜的典型結(jié)構(gòu)為柱狀或蘑菇狀[23]，這些結(jié)構(gòu)特征有利于細(xì)菌在生物膜內(nèi)不斷重復(fù)粘附、繁殖、成熟、脫落和播散感染的自我繁殖過程，不受外界干擾，且抗生素和抗菌劑難以滲透發(fā)揮作用[24]。

張洪輝[25]通過掃描電鏡觀察體外生物膜模型發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長，細(xì)菌數(shù)量增多，生物膜增厚，結(jié)構(gòu)逐漸穩(wěn)定。培養(yǎng)5d后，菌體表面覆蓋胞外多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物(EPS)，互相凝集緊密包裹，形成成熟的生物膜；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察兔耳傷口上銅綠假單胞菌生物膜發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞形成團(tuán)片狀，隆起于皮膚表面，包裹于胞外多糖-蛋白復(fù)合物(EPS)之間，趨于成熟。Johani等[7]通過電鏡在58例糖尿病足潰瘍慢性傷口標(biāo)本中觀察到 56例存在生物膜結(jié)構(gòu)，顯示球菌菌落被包裹在不同厚度的細(xì)胞外基質(zhì)(EPS)中，未被包裹部分可見菌體的清晰形態(tài)。掃描電鏡雖然可用來觀察生物膜的大致結(jié)構(gòu)，但對其內(nèi)部成分無法識(shí)別，因此特異性較差，并且在脫水過程中可能會(huì)破壞生物膜本身的結(jié)構(gòu)而影響觀察，實(shí)驗(yàn)周期較長，不利于保證識(shí)別后進(jìn)行臨床干預(yù)的時(shí)效性。

3.2.2激光共聚焦顯微鏡 激光共聚焦顯微鏡(簡稱“共聚焦顯微鏡”)彌補(bǔ)了掃描電鏡無法特異性識(shí)別的缺點(diǎn)，被認(rèn)為是目前識(shí)別生物膜較為理想的方法。該方法可使用染色劑對生物膜中各種成分如多糖、DNA、蛋白質(zhì)進(jìn)行不同顏色的熒光染色，或使用凝集素特異性結(jié)合其中成分，通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行平面觀察或連續(xù)斷層掃描，發(fā)出特定顏色進(jìn)行識(shí)別[24]。利用所得生物膜的平面圖片可重建3D圖像，通過圖像軟件對生物膜的各種指標(biāo)如厚度、比表面積、各種熒光的強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行量化，比較細(xì)菌形成生物膜的動(dòng)態(tài)過程中的各種量化數(shù)據(jù)[9，26]，進(jìn)一步探索不同干預(yù)方法對清除生物膜的效果以指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

有研究[25]使用Alexa Fluor 647熒光染料標(biāo)記生物膜細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白質(zhì)成分，染色后發(fā)出藍(lán)色熒光；SYTO9 PI標(biāo)記活菌，染色后發(fā)出綠色熒光，經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察可見活菌細(xì)胞與胞外蛋白緊密包裹，呈棉絮狀或集云狀；經(jīng)三維重建圖形發(fā)現(xiàn)生物膜厚度增加，細(xì)菌聚集緊密，代謝減慢, 生物膜結(jié)構(gòu)中通道和間隙的孔徑和數(shù)目減少，逐漸達(dá)到相對穩(wěn)定成熟的狀態(tài)。Yu等[27]采用凝集素-刀豆蛋白A與銅綠假單胞菌生物膜中胞外多糖特異性結(jié)合；SYTO45標(biāo)記細(xì)菌，觀察生物膜形成過程中多糖及細(xì)菌分布情況，并且此種方法在操作過程中大大降低生物膜的減少與缺損程度。

4 小結(jié)

細(xì)菌生物膜所致的慢性傷口感染已成為傷口管理關(guān)注的焦點(diǎn)，通過其臨床特點(diǎn)及最新判斷標(biāo)準(zhǔn)初步識(shí)別及實(shí)驗(yàn)室方法準(zhǔn)確診斷對于明確生物膜感染及制定相應(yīng)治療策略至關(guān)重要。目前關(guān)于傷口生物膜的研究以體外及動(dòng)物模型為主，臨床研究雖有增多趨勢，但數(shù)量仍較少，文獻(xiàn)中慢性傷口類型單一，未來需進(jìn)一步在臨床實(shí)驗(yàn)中深入研究。

預(yù)計(jì)未來的研究重點(diǎn)可能包括：(1)由于臨床識(shí)別的主觀性，實(shí)驗(yàn)診斷的復(fù)雜性，能否發(fā)明一些簡易便攜式的實(shí)時(shí)監(jiān)測生物膜設(shè)備，這將更具有臨床使用前景；(2)建立傷口細(xì)菌培養(yǎng)、生物膜電鏡觀察、共聚焦顯微鏡熒光染色標(biāo)本采集及預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)化流程以規(guī)范及統(tǒng)一操作方法，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；(3)增加生物膜感染的臨床研究，通過臨床與實(shí)驗(yàn)室識(shí)別工具相結(jié)合的方法探究不同干預(yù)方法對清除生物膜的效果比較以指導(dǎo)臨床實(shí)踐。