黃 喆, 周 靜, 潘素君, 劉 敬, 戴良英, 李 魏*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙 410128;2.婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林工程學(xué)院, 湖南 婁底 417000

植物借助先天免疫反應(yīng)和受侵染部位產(chǎn)生的系統(tǒng)信號抵御病原微生物的入侵。植物先天免疫系統(tǒng)可分為兩大類，一類是由病原物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng) (PAMP-triggered immunity，PTI)，它構(gòu)成植物體內(nèi)免疫反應(yīng)的第一道防線。另一類是由病原菌效應(yīng)因子(effector) 激發(fā)的免疫反應(yīng) (effector-triggered immunity，ETI)，為植物免疫反應(yīng)的第二道防線。在ETI反應(yīng)中，效應(yīng)因子是病原菌為了能夠成功侵染植物，克服寄主細(xì)胞自身免疫系統(tǒng)的識別而產(chǎn)生。然而效應(yīng)因子扮演著雙重角色，既是抗性抑制因子又是抗性誘導(dǎo)因子[1]。丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)屬革蘭氏陰性菌，是為害十分廣泛的植物病原細(xì)菌，它可以感染植物的地上部分，使植物出現(xiàn)葉斑病、葉片壞死、潰瘍病等疾病[2]。根據(jù)該菌侵染寄主植物方式的不同以及所致病害的不同特征，可將丁香假單胞桿菌大約分為64個致病變種，每個致病變種中都有多個效應(yīng)因子[3]。隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，效應(yīng)因子已成為當(dāng)前生物學(xué)研究的熱門領(lǐng)域之一。本文主要介紹了丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子在植物體內(nèi)致病和誘導(dǎo)抗性的分子機制，以期對植物抗病機理研究、植物病害防治以及農(nóng)作物抗性基因與種質(zhì)資源挖掘、抗病遺傳育種等領(lǐng)域提供參考信息和策略。

1 效應(yīng)因子的分類

最初，人們把病原菌效應(yīng)因子理解為一類能夠改變寄主結(jié)構(gòu)與功能的蛋白[4]。因此，效應(yīng)因子又被稱為效應(yīng)蛋白[5]。效應(yīng)因子根據(jù)其介導(dǎo)的病原物-寄主植物親和或者不親和互作可分為毒性(Vir)效應(yīng)因子和無毒(Avr)效應(yīng)因子。

1.1 丁香假單胞桿菌TTSS系統(tǒng)

病原菌一旦進入寄主細(xì)胞間隙，則主要通過分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞內(nèi)傳遞效應(yīng)因子[6,7]。植物病原細(xì)菌在寄主植物體內(nèi)的生存方式有賴于其自身分泌的效應(yīng)因子。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌效應(yīng)因子的分泌系統(tǒng)共有6類(I～VI)[8,9]。細(xì)菌通過寄主植物的自然孔口(例如氣孔)或傷口進入植物并在細(xì)胞間隙中增殖，其中一個主要的發(fā)病機制是由III型分泌系統(tǒng)(type three secretion system, TTSS)所介導(dǎo)的[10～12]。研究發(fā)現(xiàn)植物病原菌的TTSS具有向寄主細(xì)胞注射致病性因子、輸出Harpins、運輸效應(yīng)蛋白的功能[13,14]。因此，TTSS是丁香假單胞桿菌侵染過程中重要的蛋白分泌系統(tǒng)，其由hrp基因編碼[15]。Jin等[16]和Li等[17]研究表明，丁香假單胞桿菌的TTSS系統(tǒng)具有較長的菌毛，該菌毛能夠引導(dǎo)效應(yīng)蛋白通過植物細(xì)胞壁和植物細(xì)胞膜或者通過植物質(zhì)膜。通過該系統(tǒng)，病原菌效應(yīng)蛋白被直接注入宿主細(xì)胞中，對寄主的防御機制起到抑制作用，從而使病原菌在寄主體內(nèi)得以進一步繁殖和侵染[18,19]。許多丁香假單胞桿菌的III型效應(yīng)因子(type III effectors, T3Es)是調(diào)控植物與病原微生物相互作用的關(guān)鍵性因子[20]。這些T3Es中很多具有不同酶活性，包括半胱氨酸蛋白酶(如AvrPphB和AvrRpt2)、單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(HopU1和HopF2)、磷酸蘇氨酸裂解酶(HopAI1)、E3泛素連接酶(AvrPtoB)和蛋白酪氨酸磷酸酶(HopAO1)等[21,22]，利用這些酶調(diào)控寄主植物體內(nèi)的一系列抗病與感病反應(yīng)。雖然TTSS的注射和運輸機制仍在探究和摸索之中，但人們已經(jīng)普遍接受它是植物病原細(xì)菌致病和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)過程中所必須的蛋白分泌系統(tǒng)。

1.2 丁香假單胞桿菌毒性效應(yīng)因子

毒性效應(yīng)因子，如丁香假單胞桿菌的VirPphA、 HopAI1、 HopM1、HopU1、HopF2等，能以不同的方式破壞植物的免疫系統(tǒng)，它們介導(dǎo)丁香假單胞桿菌與寄主植物間的親和作用[21,23～25]。VirPphA是P.syringaepv.phaseolicola中最早鑒定出具有毒性功能的效應(yīng)因子[23]，它可以抑制其他效應(yīng)因子激發(fā)宿主產(chǎn)生過敏反應(yīng)，促進病原微生物加速對宿主的侵染。RIN4是HopF2的主要毒力靶標(biāo)，HopF2可以通過靶向擬南芥RIN4蛋白以促進丁香假單胞桿菌的毒力，另外HopF2也可以在擬南芥體內(nèi)與寄主AtMKK5蛋白互作，從而抑制寄主的PTI反應(yīng)[24,26]。2014年，Block等[27]研究表明丁香假單胞桿菌番茄變種 DC3000的毒性效應(yīng)因子HopD1通過定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與宿主膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NTL9相互作用來抑制植物的ETI反應(yīng)。另外，丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子HopAF1、HopB1和HopG1等毒性效應(yīng)因子可通過阻斷乙烯誘導(dǎo)、特異性地破壞免疫受體BAK1以及促進宿主轉(zhuǎn)錄抑制因子降解等方式抑制植物的天然免疫系統(tǒng)[28～31]?？傊?，近年的研究表明丁香假單胞桿菌可以進化出不同的毒性效應(yīng)因子，以不同的方式干擾或破壞植物的免疫系統(tǒng)，進而侵染宿主細(xì)胞。

1.3 丁香假單胞桿菌無毒效應(yīng)因子

病原物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)因子能夠抑制寄主植物的PTI反應(yīng)，為克服毒性效應(yīng)因子的這種抑制作用，植物隨之進化出相應(yīng)的R蛋白感知病原物分泌的效應(yīng)因子，激活過敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)，即ETI。此時的效應(yīng)因子被稱之為無毒(Avr)效應(yīng)因子。病原物Avr基因與植物R基因之間的特異性識別與互作是植物實現(xiàn)抗病性的關(guān)鍵。第一個克隆到的Avr基因是來源于丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)的avrA基因[32,33]。另外，丁香假單胞桿菌中的Avr基因，如AvrPphB、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpm1、AvrRpt2等介導(dǎo)丁香假單胞桿菌與寄主植物間的不親和作用也被人們深入研究。病原物Avr基因進入寄主細(xì)胞后，往往會對寄主細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白進行修飾或化學(xué)催化，而這種修飾或者化學(xué)催化作用會被寄主體內(nèi)的R蛋白識別進而引起HR。如丁香假單胞桿菌的Avr效應(yīng)因子AvrRpt2能夠剪切植物蛋白RIN4，從而激活寄主植物體內(nèi)的R蛋白RPS2，進而啟動基因?qū)虻目剐訹34～36]。而丁香假單胞桿菌的AvrB和AvrRpm1則磷酸化RIN4，被磷酸化修飾的RIN4被寄主植物體內(nèi)的R蛋白RPM1感應(yīng)后即激發(fā)HR反應(yīng)[37]。

有意思的是，病原微生物的毒性效應(yīng)因子與無毒效應(yīng)因子介導(dǎo)親和作用還是不親和作用并不是絕對的，而是由寄主體內(nèi)有無相應(yīng)的R基因決定的。當(dāng)無毒效應(yīng)因子對應(yīng)的寄主體內(nèi)的R基因缺失或者喪失功能時，無毒效應(yīng)因子就會變?yōu)槎拘孕?yīng)因子，介導(dǎo)親和作用[38]。如丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子AvrRptoB能與番茄抗性基因Pto互作引發(fā)HR反應(yīng)，但在缺失Pto的植物中，AvrRptoB便會抑制寄主植物的程序性壞死反應(yīng)，促進細(xì)菌的生長[39,40]。再如丁香假單胞桿菌III型效應(yīng)因子AvrRpm1和AvrRpt2在沒有抗性蛋白RPM1和RPS2的情況下通過靶向F-box蛋白COI1依賴性信號傳導(dǎo)途徑來促進細(xì)菌毒力[41]。

2 丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子與寄主植物R基因的互作方式

目前，關(guān)于丁香假單胞桿菌Avr效應(yīng)因子和寄主植物體內(nèi)的R基因的識別方式主要有2種假說，一是直接識別模式，另一種是間接識別模式。

2.1 直接識別模式

直接識別模式又稱受體-配體模型。早期，Harold Flor從遺傳學(xué)角度提出了“基因?qū)颉奔僬f，并且表征了數(shù)十種R-Avr基因組合[1,42]。該假說簡而言之就是寄主植物通過其體內(nèi)的R基因產(chǎn)物直接識別對應(yīng)的病原微生物的無毒效應(yīng)因子，進而產(chǎn)生強烈的抗病反應(yīng)即HR。例如，丁香假單胞桿菌分泌的無毒效應(yīng)蛋白AvrPto與寄主植物的R蛋白Pto產(chǎn)生直接物理互作進而激發(fā)Pto介導(dǎo)的HR[43]。然而，就現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，人們對于之前被認(rèn)為是直接識別關(guān)系的R-Avr組合又有了新的見解，并且對于許多R-Avr組合，其物理上的相互作用尚未被觀察到，所以這種R-Avr直接識別的方式并不多見。

2.2 間接識別模式

近年來，有大量報道指出植物許多R蛋白與病原物Avr蛋白之間并不發(fā)生直接的物理互作，而是通過一種間接的方式進行識別。目前，間接識別模式最常見的有警戒模式 (guard model) 和誘餌模式 (decoy model)兩種。

2.2.1警戒模式 警戒模式即病原物效應(yīng)因子與寄主植物體內(nèi)的靶標(biāo)蛋白(中間蛋白)識別后，對該靶標(biāo)進行剪切或修飾，R蛋白在監(jiān)測到中間蛋白的剪切或修飾后被激活，從而觸發(fā)寄主的ETI。這種情況下，中間蛋白起到病原物入侵警戒的作用，因此該互作方式被稱為警戒模式[1,44]。警戒模型最初是為了解釋番茄R蛋白Pto和Prf對丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子AvrPto的感知機制[1]。目前有大量研究結(jié)果證實了警戒模式，如擬南芥體內(nèi)的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶PBS1之前一直被認(rèn)為是R基因，后來有研究證明丁香假單胞桿菌的效應(yīng)因子AvrPphB本質(zhì)是半胱氨酸蛋白酶，它首先通過對自己進行剪切激活，再剪切寄主體內(nèi)的PBS1，寄主體內(nèi)的R蛋白RPS5在監(jiān)測到PBS1被剪切后隨即被激活，從而誘導(dǎo)了ETI，出現(xiàn)HR反應(yīng)[45]。再如上文所提及的效應(yīng)因子AvrRpt2、AvrRpm1及AvrB磷酸化修飾或剪切它們共同的靶標(biāo)RIN4后，被修飾過的RIN4至少能夠被RPS2和RPM1這兩種NBS-LRR蛋白監(jiān)控識別，進而引起HR抗病反應(yīng)[35]。

警戒模式在一定程度上解釋了一個R蛋白如何識別多個效應(yīng)因子，這樣的話，植物就能利用相對較小范圍的R基因庫抵御廣泛多樣的病原體[1,46]。但是2005年Chisholm等[47]在其研究報告中指出，效應(yīng)因子AvrRpt2的靶蛋白并不是專一的，該效應(yīng)因子不僅能夠裂解RIN4，還能裂解其他可能的靶蛋白。但警戒模式并不能解釋這一現(xiàn)象，因此，該模式的理論缺陷也在此。

2.2.2誘餌模式 2008年Van和Kamoun[48]基于警戒模式提出了誘餌模式。誘餌是指寄主植物中一種在序列或結(jié)構(gòu)上類似于真正靶蛋白的抗病蛋白?？梢岳斫鉃榧闹髦参餅榱说挚共≡锶肭?，進化出與病原物效應(yīng)因子真正靶蛋白的結(jié)構(gòu)與序列相似的假靶標(biāo)，該假靶標(biāo)一旦被效應(yīng)因子錯誤識別后，就會激活R基因介導(dǎo)的HR。值得注意的是，在任何情況下，誘餌模式都意味著R蛋白識別的效應(yīng)物靶標(biāo)是誘餌(假靶標(biāo))，但該模式并不適用于病原物效應(yīng)因子缺乏對應(yīng)的R蛋白這一情況[48]。如丁香假單胞桿菌的效應(yīng)因子AvrPphB可以通過剪切擬南芥體內(nèi)的類受體激酶BIK1及其同源蛋白PBLs以發(fā)揮其致病作用，植物為此進化出與BIK1和PBLs同源的PBS1蛋白，當(dāng)效應(yīng)因子AvrPphB錯誤識別PBS1并切割該蛋白后，立即激活植物體內(nèi)由RPS5介導(dǎo)的HR反應(yīng)[49]。又如AvrPto的真正靶標(biāo)是FLS2和EFR1，植物為避免真正靶標(biāo)被AvrPto識別，進化出一種類似蛋白激酶，即誘餌蛋白Pto，該蛋白作為中間蛋白競爭性的與效應(yīng)因子結(jié)合，從而引發(fā)Prf介導(dǎo)的HR反應(yīng)[50]。誘餌模式仍有待進一步研究證明，目前尚無具體研究證據(jù)對警戒模式和誘餌模式進行確切的劃分。因為這兩個模式不一定是相互排斥的，當(dāng)警戒模式演變成誘餌模式時，可能會出現(xiàn)中間階段。因此，警戒模式的許多預(yù)測也適用于誘餌模式。

3 展望

總體而言，研究效應(yīng)因子是了解植物抗病分子機制的先決條件，也是植物病理學(xué)研究的一個熱點。植物的抗病性和病原物的致病性并不是恒定不變的，在自然選擇的作用下, 病原物為提高它的致病性會不斷產(chǎn)生新的致病效應(yīng)因子用于攻克植物免疫系統(tǒng)，反過來，植物面對病原物的侵染也會不斷進化出新的抗病基因以增強它的抗病性來抵御病原物[51]。因此，病原物效應(yīng)因子與寄主之間的互作是不斷進化發(fā)展的。目前，雖然人們對這方面的研究日益深入，但仍有許多不清楚的地方，如R基因識別病原微生物效應(yīng)因子之后是如何激活下游免疫應(yīng)答的？人們能否設(shè)計出廣譜識別Avr基因的R基因？這些問題都有待進一步探究和解釋。

作為模式菌種，深入了解丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子與寄主的互作分子機制、植物的抗病機制以及病原物的致病機制，將對植物抗病機理研究、植物病害防治等領(lǐng)域做出巨大貢獻，同時也有利于挖掘新的抗性基因與抗性種質(zhì)資源并利用遺傳手段培育優(yōu)良的抗病植物品種。