喬 宇, 石 波

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 北京 100081

致病性沙門氏菌(Salmonellaspp.)和大腸桿菌(Escherichiacoli)是兩類常見的引起人畜共患病的病原菌[1]。沙門氏菌和大腸桿菌是桿狀、不產(chǎn)孢子的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬腸桿菌科。目前已報(bào)道的沙門氏菌血清型有2 500余種，我國有290多種血清型[2,3]。不同血清型的沙門氏菌的致病性存在差異，能夠引起傷寒、副傷寒以及胃腸道疾病等[4]。據(jù)歐洲食品安全局報(bào)道，歐洲新鮮豬肉中沙門氏菌的檢出率為0.7%～26%[5]。在2013年歐洲爆發(fā)的傳染性疾病中沙門氏菌病占25.8%(2013年共88 715例)[5]。Jackson等[6]報(bào)道，美國在1998年-2008年80%的沙門氏菌病是由雞蛋和雞肉感染沙門氏菌引起的。根據(jù)測算，我國每年因沙門氏菌食物中毒的發(fā)病人數(shù)達(dá)300萬人次，其中近半數(shù)與生雞肉交叉污染有關(guān)。

大腸桿菌普遍存在于人類和畜禽腸道內(nèi)，大部分血清型作為腸道內(nèi)的共生菌是沒有毒性的，僅少數(shù)血清型的大腸桿菌具有致病性，可引起嚴(yán)重的腸道感染[7, 8]。致病性大腸桿菌有6種類型：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)、腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicE.coli，EPEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhageE.coli，EHEC)、腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregativeE.coli，EAEC)及彌散黏附性大腸桿菌(diffusely adherentE.coli，DAEC)[9]。2014年歐洲爆發(fā)的傳染性疾病中1.7%是由產(chǎn)腸毒素的致病性大腸桿菌引起的[10]，新鮮豬肉中致病性大腸桿菌的檢出率為0～70%[1]。尤其是仔豬斷奶階段，ETEC引起的腹瀉病具有發(fā)病率高、死亡率高、使仔豬生長性能嚴(yán)重下降等特點(diǎn)，給養(yǎng)殖行業(yè)帶來巨大危害，并嚴(yán)重威脅著人類健康[11,12]。我國致病性大腸桿菌主要來源于畜禽產(chǎn)品、被動(dòng)物糞便污染的水和土壤[9]。

控制畜禽養(yǎng)殖中沙門氏菌和大腸桿菌的污染主要包括養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰加工環(huán)節(jié)以及運(yùn)輸和零售環(huán)節(jié)。其中，在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)抑制沙門氏菌和大腸桿菌增殖是最為有效的控制病原菌進(jìn)入食物鏈的手段。畜禽養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生消毒、畜禽注射疫苗等手段只能在一定程度上防治沙門氏菌和大腸桿菌?？股刈鳛橐环N可有效地抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染的抗菌藥物，被廣泛地應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中[1,6]。近年來，隨著多重抗生素耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)以及人們對畜禽產(chǎn)品抗生素殘留認(rèn)識(shí)的深入，在畜禽養(yǎng)殖中添加的抗生素即將被一些綠色飼料添加劑取代。糖生物學(xué)和糖工程技術(shù)的迅速發(fā)展逐漸揭示出糖及糖鏈的生物學(xué)功能，其中對于功能性糖在抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染方面的研究取得了一定的進(jìn)展。本文就沙門氏菌和大腸桿菌的宿主感染機(jī)制以及功能性糖抑制其感染的機(jī)制等方面的最新研究成果進(jìn)行了綜述，以期為解析功能性糖抑制病原微生物的作用機(jī)理提供參考，指導(dǎo)功能性糖抑制病原微生物的應(yīng)用研究，最終實(shí)現(xiàn)功能性糖替代抗生素防治畜禽細(xì)菌病。

1 功能性糖在抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，糖廣泛參與基本的生命活動(dòng)，在疾病的發(fā)生和發(fā)展、免疫系統(tǒng)的識(shí)別和介導(dǎo)、炎癥及病原體感染過程中發(fā)揮了重要作用[13]。其中，功能性糖在抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染方面表現(xiàn)出特有的功效。功能性糖在體外細(xì)胞試驗(yàn)中能夠抑制沙門氏菌和大腸桿菌與腸道上皮細(xì)胞粘附，減少炎癥反應(yīng)；在動(dòng)物飼喂試驗(yàn)中能降低病原菌的數(shù)量，增加有益菌的數(shù)量，促進(jìn)畜禽腸道發(fā)育。因此，對可抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染的功能性糖及其效果進(jìn)行了總結(jié)(表1)。

功能性糖共有3大類：寡糖、多糖和糖復(fù)合物。寡糖包括乳果糖、幾丁寡糖、低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)、低聚果糖(fructo-oligosaccharide，F(xiàn)OS)、酵母細(xì)胞壁甘露寡糖(mannan oligosaccharide，MOS)和棉子糖等；多糖包括β-半乳甘露聚糖、阿拉伯木聚糖、胞外多糖、可溶性非淀粉多糖、菊粉等；糖復(fù)合物有酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)。其中，酵母細(xì)胞壁甘露寡糖和β-半乳甘露聚糖在體外細(xì)胞試驗(yàn)中均可減少沙門氏菌和大腸桿菌與小腸上皮細(xì)胞的粘附，下調(diào)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的分泌[14～17]，β-半乳甘露聚糖還能夠顯著降低肉雞腸道的大腸桿菌數(shù)量(數(shù)據(jù)未發(fā)表)；而在斷奶仔豬日糧中添加乳果糖，能減少仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量，促進(jìn)仔豬小腸發(fā)育[19]，在體外純培養(yǎng)試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)乳果糖可抑制沙門氏菌的生長[24]。

2 沙門氏菌和大腸桿菌宿主感染機(jī)制

沙門氏菌和大腸肝菌感染宿主分為3個(gè)階段：粘附、效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、病原菌在宿主細(xì)胞中增殖(圖1)[1]。

沙門氏菌和大腸桿菌粘附到宿主細(xì)胞表面：2種病原菌經(jīng)口服進(jìn)入宿主體內(nèi)，2～3 h后到達(dá)小腸，粘附到小腸的黏蛋白和小腸上皮細(xì)胞表面，這一過程可通過2種粘附機(jī)制實(shí)現(xiàn)。首先，沙門氏菌和大腸桿菌的黏附素，如菌毛(EHEC聚集性的黏附因子)、鞭毛(Salmonellaenterica的Saf聚黏附因子)或表面抗原(ETEC大腸桿菌表面抗原)，識(shí)別宿主細(xì)胞上的受體[16,27,28]，如沙門氏菌菌毛與宿主神經(jīng)氨酸包含蛋白識(shí)別[29]以及AIEC菌毛、鞭毛與宿主的癌胚抗原識(shí)別[30]均屬這一過程。其次，沙門氏菌和大腸桿菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)將黏附素轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞表面，完成病原菌附著的第一步。此外，2種病原菌聚集在宿主腸上皮細(xì)胞表面形成細(xì)菌生物膜也是其粘附的重要因素[31]，常見于EAEC和EPEC菌株[32]，這些生物膜的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由菌毛、鞭毛和胞外多糖等結(jié)構(gòu)組成[33]。

表1 功能性糖對沙門氏菌和大腸桿菌的抑制結(jié)果Table 1 Inhibitory effects of functional carbohydrates on Salmonella and E. coli.

圖1 沙門氏菌和大腸桿菌子在畜禽體內(nèi)的定殖方式和致病性示意圖[1,8,26]Fig.1 Schematic representation of the colonization ways and pathogenicity of Salmonella enterica and Escherichia coli into livestock and poultry host[1,8,26].

宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)病原菌效應(yīng)蛋白：致病性沙門氏菌和大腸桿菌粘附到宿主細(xì)胞后，通過T3SS將細(xì)菌效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外空間或宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[34]。這些效應(yīng)蛋白幫助病原菌抵抗宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，通過誘導(dǎo)多個(gè)可破壞宿主腸道細(xì)胞的緊密連接和炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路引發(fā)細(xì)胞裂解、破壞腸道穩(wěn)態(tài)，使病原菌最終入侵宿主的器官組織[1]。

宿主病原菌的入侵和復(fù)制：沙門氏菌定植在腸上皮細(xì)胞、粘液和腸粘膜基底膜表面，引起粘膜炎癥，從而產(chǎn)生含半乳糖的糖脂和粘蛋白等物質(zhì)；隨后，沙門氏菌利用這些營養(yǎng)物質(zhì)獲得快速增殖[35]。幾乎所有的沙門氏菌都能在吞噬細(xì)胞(樹突細(xì)胞、M細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞)和中性粒細(xì)胞中增殖和存活[36]。這一過程需沙門氏菌的效應(yīng)蛋白SPI-2的參與，SPI-2通過修飾宿主細(xì)胞的液泡，幫助沙門氏菌逃脫溶酶體的降解[37]。沙門氏菌還能快速侵染腸相關(guān)的淋巴組織，在口腔感染了沙門氏菌后，其可迅速轉(zhuǎn)移到扁桃體、空腸和回腸淋巴結(jié)[38]。而與沙門氏菌相反，多數(shù)大腸桿菌存在于細(xì)胞外，在呼吸道內(nèi)腔、中空腸到回腸的宿主細(xì)胞外生長[28]。大腸桿菌僅能利用腸上皮細(xì)胞和粘液釋放的單糖(葡萄糖酸鹽、甘露糖、巖藻糖和核糖)、其他的粘液糖蛋白和氨基酸增殖生長[1]。

3 功能性糖抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染的機(jī)制

功能性糖抑制沙門氏菌和大腸桿菌感染的機(jī)制包括阻斷粘附位點(diǎn)、改善腸道內(nèi)環(huán)境和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等。

3.1 阻斷病原菌的粘附位點(diǎn)

功能性糖作為病原菌宿主受體蛋白的結(jié)構(gòu)類似物可以阻斷病原菌的粘附。功能性糖可結(jié)合于病原菌黏附素的糖結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而阻斷病原菌對宿主細(xì)胞的粘附[22,39]，如小麥可溶性提取物阿拉伯木聚糖、CGMP、幾丁寡糖、GOS等均可作為抗粘附劑抑制ETEC或EPEC在豬IPEC-J2細(xì)胞或人Hep-2細(xì)胞上的粘附(表1)。

不同進(jìn)化起源的腸道致病菌沙門氏菌和大腸桿菌都具有Ⅰ型菌毛，其與宿主細(xì)胞表面糖蛋白的甘露糖殘基有很高的親和力。正是這一結(jié)合位點(diǎn)決定了病原菌在腸上皮細(xì)胞的粘附和定植。富含甘露聚糖的功能性糖，如酵母細(xì)胞壁甘露寡糖和半乳甘露聚糖，能夠抑制沙門氏菌和大腸桿菌Ⅰ型菌毛上的FimH黏附素分子與宿主細(xì)胞的粘附(表1)。ETEC具有Ⅳ型菌毛，可與唾液酸化的糖蛋白和中型鞘糖脂的半乳糖殘基結(jié)合[18]，因此，富含半乳糖的功能性糖能夠抑制大腸桿菌與宿主細(xì)胞的粘附。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，存在于刺槐豆膠中的β-半乳甘露聚糖降低大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌與豬腸道IPI-2I細(xì)胞表面的粘附[18,19]。

Shoaf等[21]研究發(fā)現(xiàn)菊粉能夠抑制ETEC與人小腸上皮細(xì)胞Caco-2和人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2的粘附；但在Chen等[24]的報(bào)道中，菊粉不具備抑制粘附的功效。這說明不同結(jié)構(gòu)的功能性糖對不同血清型病原菌和宿主細(xì)胞類型的抗粘附功效存在差異。

3.2 促進(jìn)有益菌的增殖

乳果糖可選擇性地促進(jìn)腸道中有益結(jié)腸細(xì)菌的生長，尤其是乳酸菌[14]，這些有益細(xì)菌可以形成生物膜，附著在腸上皮細(xì)胞上[22]，阻斷病原菌對腸上皮細(xì)胞的粘附[40,41]。此外，有益菌也顯示出了急性抗菌作用，通過產(chǎn)生病原菌受體類似物-胞外多糖(如羅伊氏乳桿菌胞外多糖-Reuteran)與病原菌[24]結(jié)合，或分泌抗菌物質(zhì)，如植物乳桿菌分泌的細(xì)菌素可抵御機(jī)體感染病原菌[41]。

3.3 下調(diào)黏附素或毒力因子的基因表達(dá)

功能性糖在畜禽腸道內(nèi)的發(fā)酵產(chǎn)物——短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFA)，包括乙酸、丙酸和丁酸，能夠抑制S.typhimurium黏附素和細(xì)菌侵染相關(guān)基因的表達(dá)。丁酸和丙酸可下調(diào)沙門氏菌毒力相關(guān)的效應(yīng)蛋白SPI-1的基因表達(dá)和EHEC菌Ⅰ型菌毛的表達(dá)，從而抑制病原菌的侵入[42,43]。此外，SCFA在沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)的累積能夠打破其滲透平衡，抑制菌自身的生長[42]。

3.4 調(diào)節(jié)畜禽腸道生理及生態(tài)環(huán)境

功能性糖可通過選擇性地刺激腸道有益菌的生長來調(diào)節(jié)腸道微生物菌群。畜禽腸道微生物群通過發(fā)酵不可消化碳水化合物來釋放SCFA，從而對畜禽的生理和健康產(chǎn)生影響。這主要是由于SCFA和乳酸可降低腸道pH，而致病性的沙門氏菌和大腸桿菌在低pH環(huán)境中生長受到抑制。如EAEC在pH 7.4時(shí)呈現(xiàn)典型的聚集模式，但在pH 4.0時(shí)會(huì)丟失生物膜，呈現(xiàn)分散的模式。Fooks和Gibson[44]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)在pH<5.0時(shí)不生長。

3.5 增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫功能

病原菌在動(dòng)物體內(nèi)被降解時(shí)，會(huì)釋放病原體相關(guān)分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，激活抗原呈遞細(xì)胞，將T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為樹突細(xì)胞和T輔助細(xì)胞[45]。一些功能性多糖屬PAMP類物質(zhì)，可作為免疫刺激劑(immunostimulant)增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)單核細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，激活T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性；還可促進(jìn)細(xì)胞因子如IL-1、IL-2、TNF-α、TNF-β等生成，促進(jìn)抗體和補(bǔ)體的形成[46]。White等[47]的研究表明，啤酒酵母干酵母來源的MOS可提高血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)水平，抑制大腸菌群增殖。此外，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的糖還包括多種來源的葡聚糖[45]、海洋來源的多糖[48]、植物來源的黃芪多糖和蘆薈多糖[46,49]以及真菌來源的香菇多糖[9]等。

另一方面，功能性糖的腸道發(fā)酵產(chǎn)物SCFA可增加上皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)胰腺分泌活性物質(zhì)。丁酸作為一種結(jié)腸上皮細(xì)胞能量來源能夠增強(qiáng)結(jié)腸上皮細(xì)胞的屏障功能，有利于阻止機(jī)體分解，并降低DNA的氧化損傷[1]。功能性糖還可改善上皮細(xì)胞的生理功能以抵御病原菌的入侵。向斷奶仔豬的日糧中添加乳果糖或菊粉后，乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量、SCFA(尤其是結(jié)腸中的丁酸)濃度以及回腸絨毛高度，均有顯著的提高[14]。

4 展望

綜上所述，功能性糖在畜禽健康養(yǎng)殖中具有卓越的功效。首先，功能性糖具有與病原菌受體糖蛋白相似的結(jié)構(gòu)，能夠阻斷沙門氏菌、大腸桿菌與畜禽腸道上皮細(xì)胞的粘附。其次，某些功能性糖作為免疫刺激劑，可激活免疫細(xì)胞活性，增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫機(jī)能。再次，功能性糖具有非消化性，可選擇性地刺激腸道有益菌增殖，尤其是乳酸菌、雙歧桿菌，從而抑制沙門氏菌和大腸桿菌的生長。同時(shí)，功能性糖的發(fā)酵產(chǎn)物SCFA可下調(diào)黏附素或毒力因子的基因表達(dá)，增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的屏障功能。

隨著研究的不斷推進(jìn)，越來越多的功能性糖被應(yīng)用到畜禽沙門氏菌病和大腸桿菌病的防治中。但是也有一些研究表明，功能性糖對提高畜禽生長性能、減少疾病發(fā)生并無顯著效果。這說明功能性糖的防治效果與諸多因素有關(guān)，如飼料中功能性糖的添加量、畜禽養(yǎng)殖環(huán)境、動(dòng)物日齡和種類等。隨著糖生物學(xué)和糖生物工程的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究水平的不斷提高，糖生物工程產(chǎn)品必將在畜禽沙門氏菌和大腸桿菌感染的防治以及應(yīng)對養(yǎng)殖行業(yè)“禁抗、限抗”的挑戰(zhàn)中發(fā)揮出巨大的作用。