馬青霞, 殷鵬程, 林 浩, 金竹萍, 王歡慶, 楊江平, 裴雁曦*, 牛麗芳*

1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;3.克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司, 新疆維吾爾自治區(qū) 克拉瑪依 834000

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為一種優(yōu)質(zhì)牧草在世界范圍內(nèi)被廣泛種植，由于其含有黃酮類化合物、優(yōu)質(zhì)膳食纖維、食用蛋白等成分，且具有優(yōu)異的消化率和較低的生產(chǎn)成本，故而被稱為“牧草之王”[1,2]。紫花苜蓿在中國已有2 000多年栽培歷史，是我國種植歷史最久、經(jīng)濟(jì)價值最高的豆科牧草，所以苜蓿產(chǎn)量的提高可極大促進(jìn)牧草產(chǎn)量的增加。

對近年來苜蓿產(chǎn)量的分析表明，我國苜蓿產(chǎn)業(yè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于美國，以2017年為例，2017年我國國內(nèi)苜?？偖a(chǎn)量為250萬t，而美國苜?？偖a(chǎn)量已超過1 000萬t，隨著今后我國對苜蓿需求量的不斷增加，苜蓿將呈現(xiàn)供不應(yīng)求的狀態(tài)，依然需要通過進(jìn)口途徑大量獲得[3]。已有研究表明，苜蓿的產(chǎn)量受到多重因素的共同影響，包括莖葉比、生長速度、鮮干比、株高和單枝重等，其中株高是呈現(xiàn)苜蓿生長狀態(tài)、衡量其產(chǎn)量的重要指標(biāo)，株高與苜蓿產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)[4]。同時，株高也受到多個因素的影響，其中，植物激素赤霉素(gibberellic acid，GA)對株高的調(diào)控作用至關(guān)重要，早在20世紀(jì)60年代已有研究證實(shí)赤霉素的調(diào)控會對植物株高產(chǎn)生影響[5,6]。

GA作為五大植物激素之一，參與調(diào)控植物生命周期的多個過程，包括植物的開花、種子的萌發(fā)、果實(shí)的發(fā)育、葉的伸展以及莖的伸長等。迄今為止，在植物中發(fā)現(xiàn)的GA已達(dá)136種，且按時間順序?qū)⑺鼈兠麨镚A1～GA136，其中只有少量GA具有生物活性(即對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)具有生物效應(yīng))，包括GA1、GA3、GA4和GA7等[7,8]。GA水平受到多種途徑的共同調(diào)控，其中GA合成途徑是調(diào)控GA水平必不可少的過程。GA是一種由四環(huán)骨架衍生而得的雙萜類化合物，GA合成的過程可分為3個階段，在此期間參與GA合成的酶主要有古巴焦磷酸合成酶、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶、GA20-氧化酶(GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶(GA2-oxidase，GA2ox)以及GA3-氧化酶(GA3-oxidase，GA3ox)等[9]。GA20ox、GA2ox以及GA3ox是GA生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其中，GA20ox是一種雙加氧酶，其可將GA合成途徑中無生物活性的GA53和GA12氧化成有生物活性的GA20和GA9[10]。GA20ox作為GA生物合成階段的限速酶，在GA生物合成過程中起關(guān)鍵作用。

已有研究表明，在水稻、擬南芥和玉米等多個物種中，GA20-氧化酶基因的缺失會導(dǎo)致植株矮化，如水稻Os20ox2基因的缺失導(dǎo)致sd-1突變體植株出現(xiàn)半矮化的表型；擬南芥AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA20ox3基因的缺失導(dǎo)致突變體植株出現(xiàn)不同程度的矮化性狀等[9,11,12]，值得注意的是，擬南芥AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3和AtGA20ox4均具有完整的GA20-氧化酶活性，而GA20ox5不能將無生物活性的GA氧化生成有生物活性的GA。同時，在多個物種中的研究發(fā)現(xiàn)GA20-氧化酶基因的過表達(dá)植株呈現(xiàn)株高增加的表型[10,13,14]。

紫花苜蓿由于轉(zhuǎn)化效率低、基因組較大且為同源四倍體等特征不易開展基因功能解析研究，而紫花苜蓿的的近源種蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)由于生長周期較短、基因組較小、遺傳轉(zhuǎn)化效率較高和自花授粉等特點(diǎn)成為豆科模式植物，蒺藜苜蓿和紫花苜蓿在遺傳上具有相似性，因此在蒺藜苜蓿中獲取的信息也可用于紫花苜蓿。目前已有研究表明，在蒺藜苜蓿中GA20ox基因的變化與體細(xì)胞胚發(fā)生過程相關(guān)[15]，但是在蒺藜苜蓿中該基因?qū)χ旮叩恼{(diào)控尚不清楚，由于該基因功能與植株矮化的性狀密切相關(guān)，而植株矮化和半矮化的表型有利于植物抗倒伏，進(jìn)而可促進(jìn)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[16]，因此，本研究以蒺藜苜蓿為實(shí)驗(yàn)材料，通過反向遺傳學(xué)的方法對蒺藜苜蓿GA20ox基因進(jìn)行初步研究，并對其對株高的調(diào)控作用進(jìn)行深入解析，以期為進(jìn)一步研究苜蓿中GA20ox的基因功能提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 蒺藜苜蓿野生型R108由本實(shí)驗(yàn)室保存，突變體mtga20ox7-1、mtga20ox7-2以及mtga20ox8-1從美國諾貝爾研究所(Noble Research Institute)獲得。煙草種子由本實(shí)驗(yàn)室保存。

蒺藜苜蓿種子處理：選擇健康飽滿且生長狀態(tài)均勻的種子，在砂紙上將種子種皮磨破后浸泡于清水中直至種子吸水膨脹，將吸水后的種子鋪在有雙層濕濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)材料在生長條件為溫度24℃、濕度70%、光照強(qiáng)度380 μmol/m2·s、光周期16 h(光)/8 h(暗)的溫室培養(yǎng)生長。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 TRIzol、焦炭酸二乙酯(DEPC)、Gateway LR Clonase II Enzyme mix和Gateway BP Clonase II Enzyme mix均購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司;高保真酶KOD FX購自日本東洋紡公司;DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;各種限制性內(nèi)切酶均購自美國NEB公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

5424R/5702R/5430R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)，D7100照相機(jī)(日本尼康公司)，LSM700激光共聚焦顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)，電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)1600(上海天能科技有限公司)。引物合成和樣品測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 GA20ox系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及蛋白質(zhì)序列分析

從TAIR(www.arabidopsis.org)網(wǎng)站下載5個擬南芥AtGA20ox的蛋白質(zhì)序列，在MedicagotruncatulaGenome Database(http://blast.jcvi.org/Medicago-Blast/)中通過BLASTP找到與擬南芥AtGA20ox同源的MtGA20ox的蛋白質(zhì)序列，將它們進(jìn)行序列同源性比對并采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在NCBI protein數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中分析GA20ox蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，通過BioEdit的ClustalW Multiple alignment軟件對MtGA20ox與AtGA20ox蛋白進(jìn)行序列比對分析。

1.4 RT-PCR檢測MtGA20ox基因的組織表達(dá)特性

提取野生型R108不同組織的總RNA，包括生長28 d植株的根，生長40 d植株的莖，生長50 d植株的未展開的復(fù)葉、花苞，開花后10 d植株的種子以及營養(yǎng)生長時期的莖尖。反轉(zhuǎn)錄過程參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明進(jìn)行，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，利用各自基因特異性引物通過RT-PCR方法進(jìn)行基因表達(dá)量分析(引物見表1)。RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Buffer for KOD FX 10 μL，dNTPS(150 mmol/L)2 μL，KOD FX 0.4 μL，模板cDNA 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 5.1 μL。RT-PCR反應(yīng)程序：98℃ 2 min；98℃ 20 s，58℃ 20 s，68℃ 1 min；68℃ 2 min；24℃ 1 min。以MtActin為內(nèi)參，檢測基因在不同組織中的相對表達(dá)量，其中MtActin基因擴(kuò)增25個循環(huán)，MtGA20ox基因擴(kuò)增30個循環(huán)。每個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 MtGA20ox蛋白的亞細(xì)胞定位

通過Gateway系統(tǒng)，分別構(gòu)建了含有融合綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)簽的過表達(dá)載體pMDC83-35S∷MtGA20ox1-GFP、pMDC83-35S∷MtGA20ox7-GFP和pMDC83-35S∷MtGA20ox8-GFP。再通過EHA105農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時轉(zhuǎn)化的方法將3個載體分別轉(zhuǎn)入生長3～4周齡的煙草葉片中，對侵染后的煙草進(jìn)行3 d黑暗處理后在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察MtGA20ox蛋白的亞細(xì)胞定位。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment.

1.6 突變體表型觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

分別取3個50 d突變體植株進(jìn)行表型觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計，統(tǒng)計所有突變體主莖的長度，每個突變體至少統(tǒng)計15個植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 MtGA20ox蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

為了分析蒺藜苜蓿MtGA20ox與擬南芥AtGA20ox的親緣關(guān)系，通過MEGA軟件對擬南芥和蒺藜苜蓿的GA20ox蛋白進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)在蒺藜苜蓿中有8個擬南芥AtGA20ox的近緣蛋白，這與Igielski等[15]的研究結(jié)果一致。其中，與參與有活性GA合成的AtGA20ox1～4親緣關(guān)系較近的為MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8。同時，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，其他5個MtGA20ox均與GA20ox蛋白聚在1個分支。

2.2 MtGA20ox蛋白的氨基酸序列比對

通過BioEdit軟件將MtGA20ox與擬南芥AtGA20ox的氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)MtGA20ox1、MtGA20ox7以及MtGA20ox8與擬南芥AtGA20ox蛋白的氨基酸序列高度同源，且所有的氨基酸序列均含有1個保守的2OG-FeⅡ_Oxy結(jié)構(gòu)域[17,18]。

圖1 擬南芥AtGA20ox與蒺藜苜蓿MtGA20ox蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AtGA20ox and MtGA20ox.

2.3 MtGA20ox基因的表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步分析MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8在不同組織器官中的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR分別檢測了3個基因在蒺藜苜蓿各組織中的表達(dá)量。如圖3所示，MtGA20ox1在蒺藜苜蓿的根、莖、花、種子和莖尖中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量較低；MtGA20ox7在蒺藜苜蓿的根、葉、花、種子和莖尖中均有表達(dá)，在莖中表達(dá)量較低；而MtGA20ox8在蒺藜苜蓿的莖和種子中有表達(dá)，在根、葉、花以及莖尖中表達(dá)量較低。其中，MtGA20ox1、MtGA20ox7、MtGA20ox8分別在花、葉、種子中表達(dá)量最高，且它們分別與其他組織中表達(dá)量相比差異明顯，表明MtGA20ox1、MtGA20ox7以及MtGA20ox8的表達(dá)具有組織特異性[19]，可能與它們參與不同的組織發(fā)育相關(guān)。

2.4 MtGA20ox蛋白亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)是生命活動體現(xiàn)者，亞細(xì)胞定位對分析其功能及作用極其重要[20]，為了確定MtGA20ox蛋白在植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布情況，將MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8基因的編碼序列分別構(gòu)建到pMDC83載體中，得到它們分別與GFP融合的表達(dá)載體，再通過注射滲透法對煙草葉片進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化，利用激光共聚焦顯微鏡來觀察瞬時表達(dá)的綠色熒光。結(jié)果表明，MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[21]，這與前人研究的GA20ox在許多其他物種中的定位相一致[22]。

圖2 GA20ox氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequences of GA20ox.

2.5 MtGA20ox7和MtGA20ox8的突變體鑒定

為了研究MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8的基因功能，本實(shí)驗(yàn)從蒺藜苜蓿Tnt1逆轉(zhuǎn)座子插入突變體庫中篩選獲得了MtGA20ox7和MtGA20ox8對應(yīng)的插入突變體。如圖5A所示，MtGA20ox7篩選到2個Tnt1插入突變體，分別命名為mtga20ox7-1和mtga20ox7-2，其中mtga20ox7-1中Tnt1插入在第1個外顯子上，mtga20ox7-2中Tnt1插入在第2個外顯子上，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在mtga20ox7-1和mtga20ox7-2中均未檢測到全長MtGA20ox7基因的表達(dá)(圖5C)。如圖5B所示，MtGA20ox8篩選到Tnt1插入在第1個外顯子上的1個突變體mtga20ox8-1，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)在mtga20ox8-1中未檢測到全長MtGA20ox8基因的表達(dá)(圖5D)，表明這3個突變體均為基因功能缺失突變體。

2.6 突變體表型分析及主莖長度的統(tǒng)計

進(jìn)一步對得到的3個突變體進(jìn)行表型觀察和主莖長度數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。如圖6所示，mtga20ox7-1、mtga20ox7-2和mtga20ox8-1與野生型相比株高無明顯變化，上述結(jié)果表明，MtGA20ox7和MtGA20ox8的單獨(dú)突變對蒺藜苜蓿的主莖長度沒有影響。

圖3 MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8在蒺藜苜蓿不同組織中的表達(dá)模式Fig.3 Expression patterns of MtGA20ox1, MtGA20ox7 and MtGA20ox8 in different tissues of M. truncatula.

圖4 MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8在煙草表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of MtGA20ox1, MtGA20ox7 and MtGA20ox8 in tobacco epidermal cells.

圖5 MtGA20ox的基因結(jié)構(gòu)以及突變體中MtGA20ox的表達(dá)檢測Fig.5 Structures of the MtGA20ox genes and transcriptions of MtGA20ox in mutants.

圖6 突變體株高表型分析Fig.6 The phenotypes of plant height of mutants.

3 討論

中國作為草原資源大國，天然草原面積393萬km2，約占國土總面積的41.7%，僅次于澳大利亞，居世界第2位[23]。但我國苜蓿產(chǎn)量仍不理想，同時隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國對苜蓿的需求也逐年增加，因此，提高苜蓿產(chǎn)量已成為生產(chǎn)中亟待解決的問題。

已有研究表明，株高與作物產(chǎn)量和生物量密切相關(guān)。植物株高受到不同遺傳信號、環(huán)境因素和植物激素的共同調(diào)控，其中GA對株高的影響尤為重要。在水稻、玉米、擬南芥中，GA20ox基因的突變都會導(dǎo)致植株不同程度的矮化[10,12,24]，但在苜蓿中關(guān)于GA20ox基因?qū)χ旮哒{(diào)控的研究尚未開展。

擬南芥5個GA20ox同源蛋白中，AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3和AtGA20ox4均能夠在體外將無生物活性的GA12轉(zhuǎn)化為有生物活性的GA9，而在相同的反應(yīng)條件下，AtGA20ox5不能將GA12轉(zhuǎn)化為有生物活性的GA9。由此可見，在擬南芥5個同源蛋白中，AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3和AtGA20ox4具有完整的GA20ox活性，而AtGA20ox5僅催化GA12轉(zhuǎn)化為GA9的前2個反應(yīng)[9]。在蒺藜苜蓿中與擬南芥AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3和AtGA20ox4親緣關(guān)系較近的GA20ox基因有3個，分別為MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8，本實(shí)驗(yàn)通過反向遺傳學(xué)的方法對MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8基因的生理特性和功能進(jìn)行了研究。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8氨基酸序列都含有2OG-FeⅡ_Oxy結(jié)構(gòu)域。已有研究表明，2OG-FeⅡ_Oxy是一個2-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶超家族保守結(jié)構(gòu)域，2-酮戊二酸和Fe2+能與底物相互作用發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而催化赤霉素生物合成過程中不同的羥基化和去飽和步驟[25,26]，因此下一步實(shí)驗(yàn)計劃將檢測MtGA20ox是否具有酶活。

通過對篩選得到的突變體進(jìn)行表型觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)mtga20ox7和mtga20ox8突變體與野生型相比株高無變化，可能由于MtGA20ox在控制株高性狀時存在功能冗余或者這2個MtGA20ox無酶活。為了深入研究MtGA20ox基因的功能，首先需要獲得MtGA20ox1基因的功能缺失突變體，同時通過人工雜交構(gòu)建其兩兩之間的雙突變體和三突變體并對其進(jìn)行表型觀察；其次通過轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得3個MtGA20ox過表達(dá)植株觀察其是否具有株高增加的表型，最后通過測定各個突變體中GA的含量以及體外酶活實(shí)驗(yàn)確定其是否具有酶活性。