郭亞蓉, 王艷艷, 劉 軍*, 裴雁曦*

1.山西大學生命科學學院, 太原 030006;2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081

在自然界中，植物體能感受四季變化和晝夜交替，并通過調(diào)控自身基因表達的變化來適應周圍環(huán)境中光照、溫度等的改變。光受體是植物體感受外界光信號的主要物質(zhì)。在模式植物擬南芥中，CRY1和CRY2作為主要的藍光受體，在調(diào)控植物依賴藍光的光形態(tài)建成和長日照下促進開花的過程起作用[1～4]。cry2突變體在高強度藍光(50 μmol/m2·s)下胚軸表型不明顯，而在低強度藍光(0.6 μmol/m2·s)下表現(xiàn)出明顯的下胚軸伸長表型[5]。CRY2通過與下游信號分子CIBs(cryptochrome interacting basic helix-loop-helixes)或COP1/SPA1(constitutive photomorphogenic 1/suppressor of phyA-105) 互作來實現(xiàn)藍光特異的對下游基因的調(diào)控作用[6～10]。作為開花的正調(diào)控因子，CRY2通過與CIB1互作直接激活下游FT基因的表達，從而促進開花[7,11,12]。CRY2還可以通過與COP1/SPA1直接互作，抑制COP1/SPA1對CO的降解，從而促進開花[13,14]。藍光照射后，CRY2蛋白會發(fā)生磷酸化，轉(zhuǎn)化成活性形式，并發(fā)生依賴藍光的降解現(xiàn)象[5,15～17]。但目前，直接或間接通過影響CRYs磷酸化或降解作用來調(diào)控CRYs功能的作用因子在擬南芥中知之甚少。Blue-light inhibitors of cryptochromes 1 and 2(BIC1 and BIC2)是擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的兩個CRY2的抑制因子，它們可以通過抑制CRY2二聚化、磷酸化及CRY2的降解過程抑制CRY2的功能[18]。

在人和酵母基因組中，PRP8編碼一個前體mRNA剪接因子，是mRNA剪接小體中分子量最大、序列最保守的核心蛋白[19]。在擬南芥中，有兩個PRP8同源基因，At1g80070(SUS2/PRP8)和At4g38780，PRP8的表達量高于At4g38780百倍以上，因此，有報道指出At4g38780在基因組剪接方面可能沒有關(guān)鍵作用。PRP8功能完全缺失的突變體會導致胚胎致死[20]。PRP8基因突變后擬南芥基因組的整體剪接效率降低，出現(xiàn)部分內(nèi)含子保留現(xiàn)象[21]。PRP8在開花植物合子發(fā)育前期，對胚柄的正常發(fā)育起關(guān)鍵作用，其功能缺失會導致嚴重的胚胎發(fā)育異常及子葉發(fā)育不全現(xiàn)象[22]。PRP8還參與到了自主成花途徑中，PRP8突變體降低了FLOWERINGLOCUSC(FLC)反義轉(zhuǎn)錄物COOLAIR的剪接效率和對多聚腺苷酸位點的利用效率從而增加FLC基因編碼區(qū)H3K4me2的甲基化，導致FLC自身表達量升高，從而抑制植物體開花[20]。

為了獲得更多能夠影響擬南芥CRY2降解的作用因子，本研究對35S:LUC-CRY2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系進行EMS誘變和篩選，發(fā)現(xiàn)了新的PRP8等位基因突變體，該突變導致CRY2蛋白過量積累，并造成了下胚軸伸長和開花變早的表型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料 本實驗選用野生型Col-4，35S:LUC-CRY2，prp8-11擬南芥材料，均由實驗室保存。擬南芥生長條件為：光照時間為長日照(16 h光照，8 h黑暗)，生長溫度為22℃左右。

1.1.2實驗試劑 高保真酶KOD FX購自TOYOBO公司；In-fusion酶購自全式金公司；2×TaqPCRMix購自康為公司；DNA限制性內(nèi)切酶購自 Thermo Fisher Scientific公司; TRIzol Reagent、質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根公司；AxyPrepDNA膠回收及質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen公司；TransScript?Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金公司；TB GreenTMPremix ExTaqTM購自TaKaRa公司。

1.1.3實驗器材 DYY-6C電泳儀、Bio-Rad穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Roche Light Cycler 96型Real-time PCR system、Eppendorf centrifuge 5424R/5417R/5810R離心機、Bio-rad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)、Nanodrop2000C。

1.2 方法

1.2.1LUC發(fā)光檢測 在22℃，長日照溫室中種植擬南芥35S:LUC-CRY2和prp8-11植株，生長7 d，利用高分辨率化學發(fā)光檢測成像系統(tǒng)(型號：1024EB)進行LUC發(fā)光檢測。發(fā)射波長為520 nm，激發(fā)波長為480 nm，首先在明場曝光1 s，放置好樣品的位置；在樣品上均勻噴上Luciferase底物，黑暗靜置5 min，在暗箱平臺曝光10 min后，顯示出LUC的發(fā)光情況。經(jīng)過對LUC發(fā)光強度的檢測，進一步檢測出CRY2在蛋白質(zhì)水平上的表達情況。

1.2.2PRP8基因敲除載體的構(gòu)建 從TAIR 數(shù)據(jù)庫 (http://www.arabidopsis.org)下載擬南芥PRP8基因的序列，利用在線網(wǎng)站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)設(shè)計兩個sgRNA序列(表1)。使用KOD FX 擴增目的片段，限制性內(nèi)切酶StuⅠ酶切載體JRH0645，凝膠回收目的片段和線性化載體。In-fusion連接且轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆，保存菌株，并由北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.3擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 在22℃，長日照溫室中種植擬南芥Col-4，待大部分植株形成頂端花序后，去除已經(jīng)結(jié)莢的部分。配制花序轉(zhuǎn)化液(含5%的蔗糖，0.03% 的Silwet-77)，用花序轉(zhuǎn)化液懸浮農(nóng)桿菌，將擬南芥的花序浸入轉(zhuǎn)化液中，30 s左右。完成轉(zhuǎn)化以后將擬南芥?zhèn)确?，黑暗放?2～24 h后，轉(zhuǎn)入正常條件培養(yǎng)，至種子成熟。

1.2.4擬南芥下胚軸長度的測定 野生型Col-4、突變體prp8-11種子春化3 d后，22℃左右，放置在黑暗、藍光(20 μmol/m2·s)、紅光(2.5 μmol/m2·s)、遠紅光(0.5 μmol/m2·s)的不同生長條件下培養(yǎng)，生長3 d左右，觀察下胚軸表型并拍照，用Image J進行下胚軸長度的測量。

1.2.5擬南芥開花統(tǒng)計 用5%的NaClO消毒種子10 min左右，之后用滅過菌的蒸餾水沖洗3次，在1/2 MS培養(yǎng)基上點種。4℃春化3 d，在長日照(16 h光照，8 h黑暗)、22℃左右的生長條件下培養(yǎng)7 d，移至營養(yǎng)土繼續(xù)培養(yǎng)?；ㄆ谑侵笍拇夯蟮姆N子放到培養(yǎng)室起至抽苔1 cm的時間，蓮座葉的統(tǒng)計主要統(tǒng)計在抽苔時擬南芥初生蓮座葉的數(shù)目。統(tǒng)計突變體蓮座葉從植株生長開始每隔一周數(shù)一次，并用簽字筆做標記，下次統(tǒng)計沒有標記的葉片，直至抽苔完成為止，所有數(shù)值的總和即為抽苔時蓮座葉總數(shù)目。

1.2.6Western Blot檢測CRY2的蛋白質(zhì)表達量

擬南芥植株春化3 d后，在持續(xù)光照，22℃條件下培養(yǎng)7 d，黑暗下生長24 h，再轉(zhuǎn)到紅光(5 μmol/m2·s)，藍光(5 μmol/m2·s)條件下，分別在0 min、5 min、10 min、20 min、30 min時刻取樣并進行蛋白質(zhì)提取。將等量的蛋白質(zhì)提取物在10%的SDS-PAGE凝膠上以90 V恒壓進行電泳操作2 h；使用半干轉(zhuǎn)的方法將蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，以20 V恒壓轉(zhuǎn)膜50 min；用5%脫脂奶粉在水平搖床封閉1 h左右，一抗CRY2(1∶1 000)室溫下孵育1～2 h，PBST洗膜3次；二抗(1∶3 000)室溫下孵育1～2 h，PBST洗膜3次；加顯色底物進行曝光顯影，保存圖片并分析。

1.2.7qRT-PCR檢測CRYs基因的表達量 擬南芥生長條件及取樣方式同1.2.5，取樣以后利用Trizol法進行總RNA的提取，參照TransGen Biotech反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript?Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)的操作說明獲取cDNA。從TAIR數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)下載擬南芥CRY1、CRY2基因的序列，用Primer 3.0(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計引物(表1)，并由北京六合華大基因科技有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用熒光特異引物，參照TaKaRa的TB GreenTMPremix ExTaqTM的操作方法，在Roche Light Cycler 96型實時熒光定量PCR儀進行。qRT-PCR反應體系為(20 μL)：SYBR Premix ExTaq10 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。每份樣品重復3次，并設(shè)置陰性對照。qRT-PCR反應程序為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，50個循環(huán)。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in the experiment.

2 結(jié)果與分析

2.1 mac1突變體的獲得

為了篩選影響CRY2蛋白降解的作用因子，本研究以LUC蛋白為篩選標記，對35S:LUC-CRY2穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因株系的EMS誘變庫進行了LUC發(fā)光檢測，獲得了一個LUC發(fā)光強度高于35S:LUC-CRY2植株的突變體mac1/LUC-CRY2(圖1A)。

圖1 擬南芥mac1突變體的篩選與表型分析Fig.1 Screening and phenotype analysis of Arabidopsis mac1 mutant.

與35S:LUC-CRY2相比，mac1/LUC-CRY2突變體表現(xiàn)出明顯的表型缺陷，包括植株矮小、葉片卷曲、早花等(圖1B)。利用已有的CRY2多克隆抗體，對mac1/LUC-CRY2突變體中CRY2蛋白水平檢測，Western Blot顯示，在較低強度藍光(5 μmol/m2·s)下，外源LUC-CRY2蛋白在0 min、5 min、15 min、30 min、60 min時的表達量都明顯高于35S:LUC-CRY2中相應時間的CRY2蛋白表達量；而內(nèi)源CRY2蛋白在30 min和60 min時的CRY2蛋白表達量明顯高于對應35S:LUC-CRY2中相應時間的CRY2蛋白表達量(圖1C)。這些結(jié)果初步顯示mac1突變導致外源轉(zhuǎn)基因LUC-CRY2蛋白的大量積累和內(nèi)源CRY2蛋白的降解變慢。

2.2 mac1是SUS2/PRP8基因的等位突變體

為了確定mac1突變位點是否與mac1表型連鎖，將mac1/LUC-CRY2突變體與野生型Col-4進行回交，對回交后第二代F2進行表型觀察和分離比計算，發(fā)現(xiàn)F2代中只有野生型和mac1突變體兩種表型，并且具有mac1/LUC-CRY2突變體表型的植株占統(tǒng)計植株總數(shù)的1/4，因此確定mac1突變位點與表型連鎖并且該突變類型為隱性單基因突變。我們進一步從F2代中挑選具有mac1表型但是不含有35S:LUC-CRY2外源轉(zhuǎn)基因的株系，用該株系繼續(xù)與Col-4進行回交，以消除基因組中其余可能的突變位點，回交4代后，從回交后代收集種子進行后續(xù)實驗。

將mac1突變體與另一個擬南芥生態(tài)型Ler進行雜交，在雜交后的F2群體中挑選具有mac1突變體表型的植株構(gòu)建圖位克隆群體，進行mac1基因定位。最終將mac1突變位點定位在1號染色體末端F18B13 BAC內(nèi)，通過測序，發(fā)現(xiàn)突變位點位于基因At1g80070的第六個外顯子上，1個鳥嘌呤核苷酸(G)突變成腺嘌呤核苷酸(A)，造成了甘氨酸轉(zhuǎn)到精氨酸的突變(圖2A)。At1g80070編碼前體mRNA剪接體中的核心剪接因子PRP8，在植物體生長發(fā)育各個時期都有表達，在胚柄發(fā)育中起主要作用，根據(jù)已有的prp8突變體編號，我們將該突變體重命名為prp8-11，以下實驗中都使用該名稱。

為了進一步確定prp8-11的突變體表型是PRP8基因突變造成的，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對野生型Col-4植株進行基因定點敲除實驗。獲得的多個后代株系prp8-cr都表現(xiàn)植株矮小、葉片卷曲和早花等類似prp8-11突變體的表型(圖2C、D)?；驕y序結(jié)果表明，表型顯著的株系均在設(shè)計的sgRNA靶標位點發(fā)生雜合突變(圖2B)。然而由于該基因突變純合致死，未能鑒定到純合prp8-11突變體植株。上述結(jié)果表明CRISPR/Cas9雜合突變體(prp8-cr)的表型是由于PRP8基因突變造成的。

2.3 prp8-11基因突變導致內(nèi)源CRY2蛋白降解變慢

CRY2蛋白在高強度藍光和低強度藍光下都可以發(fā)生降解反應，低藍光下降解速度較慢；CRY1不發(fā)生依賴于藍光的降解反應。利用已有的CRY1和CRY2蛋白抗體，在低藍光下檢測prp8-11突變對CRY2蛋白降解的影響，Western Blot顯示，與野生型Col-4相比，prp8-11突變體在轉(zhuǎn)入藍光下0 min、5 min、10 min時CRY2蛋白明顯積累，在20 min、30 min時蛋白發(fā)生降解。CRY1蛋白的表達量在轉(zhuǎn)入藍光后與野生型相比沒有發(fā)生明顯變化(圖3A)；將野生型與prp8-11突變體從黑暗轉(zhuǎn)入紅光下，CRY2和CRY1蛋白表達量與野生型相比沒有發(fā)生明顯變化(圖3B)。這些結(jié)果表明PRP8對CRY2蛋白降解有促進作用，prp8-11突變后CRY2蛋白降解變慢，prp8-11突變沒有完全抑制CRY2蛋白的降解。prp8-11突變對CRY1蛋白的表達量沒有影響。

圖2 MAC1基因的圖位克隆與開花表型驗證Fig.2 Map-based cloning and flower phenotype identification of MAC1 gene.

圖3 在不同光照條件下prp8-11中的CRY2蛋白質(zhì)累積Fig.3 CRY2 protein accumulation in prp8-11 mutant under different light.

已有的研究表明， CRY2蛋白依賴于藍光的降解反應發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，磷酸化后的CRY2蛋白依賴于26 S蛋白酶體途徑發(fā)生降解。為了鑒別PRP8對CRY2降解的促進作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平還是轉(zhuǎn)錄后水平，本研究將野生型和prp8-11突變體分別由黑暗轉(zhuǎn)到藍光和紅光條件下，檢測不同時間點Col-4和prp8-11突變體中CRY1、CRY2基因的表達情況，Real-time PCR顯示，在低藍光下，prp8-11突變體中CRY1和CRY2的表達量均低于野生型 (圖4A、B)。轉(zhuǎn)入紅光條件下后，prp8-11突變體中的CRY1和CRY2表達也同樣低于野生型(圖4C、D)。這些結(jié)果表明，在prp8-11突變體中，CRY2蛋白降解變慢不是由于基因在轉(zhuǎn)錄水平表達升高引起的，PRP8對CRY2蛋白降解過程的影響發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。

2.4 prp8-11突變體表現(xiàn)早花表型

CRY2在擬南芥中主要負責在長日照(LD)下促進開花。prp8-11突變體中CRY2蛋白降解變慢，推測可能會因為CRY2蛋白的積累而影響擬南芥的開花時間。通過對prp8-11突變體在LD下開花時間進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，prp8-11突變體開花時間明顯提前(圖5A、B)。在35S:LUC-CRY2轉(zhuǎn)基因株系中，CRY2蛋白過量表達，植株也同樣表現(xiàn)出較早的開花表型(圖5A)。這些結(jié)果表明，PRP8基因在LD下抑制擬南芥開花，這種作用很可能是通過促進CRY2蛋白降解，從而影響CRY2參與調(diào)控的開花途徑實現(xiàn)的。

2.5 prp8-11突變體表現(xiàn)下胚軸變短表型

CRY1在擬南芥中主要負責藍光下抑制下胚軸的伸長， CRY2在低藍光下對下胚軸的伸長有抑制作用。由于prp8-11在低藍光下對CRY2蛋白降解有抑制作用，推測PRP8可能參與到CRY2調(diào)控的下胚軸伸長的抑制過程中。通過分析prp8-11突變體在不同光照條件下的下胚軸長度，發(fā)現(xiàn)在黑暗、藍光(20 μmol/m2·s)、紅光(2.5 μmol/m2·s)和遠紅光(0.5 μmol/m2·s)條件下，prp8-11突變體的下胚軸明顯短于野生型Col-4(圖6)。這些結(jié)果證明PRP8有促進下胚軸伸長的功能，這個過程可以不依賴于光照而獨立存在。PRP8也參與到了其他光照相關(guān)的下胚軸長度的調(diào)控過程中。

圖4 不同光照下CRY1與CRY2基因mRNA表達量分析Fig.4 Gene expression analysis of CRY1 and CRY2 under blue or red light conditions.

圖5 prp8-11在長日照條件下表現(xiàn)出早花的表型Fig.5 prp8-11 shows early flowering phenotype in long day.

3 討論

本研究首次揭示了PRP8基因有促進 CRY2降解和下胚軸伸長的新功能，并且證明PRP8對擬南芥開花有抑制作用。到目前為止，在擬南芥中除已經(jīng)證實的BIC1和BIC2外，已知的能夠影響CRY2降解的作用因子知之甚少[18]。因此本研究彌補了該方面的研究空白，為進一步了解CRY2的降解過程及其作用機理提供了依據(jù)。

根據(jù)本研究結(jié)果，PRP8促進CRY2蛋白降解，但其作用機制還不清楚。我們推測，PRP8作為前體mRNA剪接因子，可能通過影響CRY2前體 mRNA的剪接，改變了CRY2蛋白的結(jié)構(gòu)，最終影響了CRY2蛋白的降解。已有的研究結(jié)果表明，PRP8基因突變后植物基因組會發(fā)生內(nèi)含子保留現(xiàn)象[21]，如果有內(nèi)含子保留在CRY2 mRNA中并成功翻譯成蛋白質(zhì)，導致CRY2蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，后續(xù)的降解過程很可能因此受到影響。此外，PRP8功能完全喪失的突變體導致胚胎致死，因此本研究獲得的是功能不完全缺失的突變體，在表型觀察時，也可能導致對CRY2蛋白降解的影響不明顯，而實際上PRP8對CYR2蛋白降解的影響可能會更顯著。

圖6 prp8-11在不同光照條件下下胚軸表型Fig.6 Hypocotyl phenotype of prp8-11 in different light conditions.

在擬南芥中，CRY2和PRP8都具有促進開花的功能。在自主成花途徑中，PRP8基因突變導致FLC基因表達上調(diào)，從而抑制植物開花。本研究中，prp8-11突變體表現(xiàn)出早花表型，因此推測，PRP8在自主成花途徑之外，還參與其他開花相關(guān)途徑。CRY2通過CIBs或COP1/SPAs途徑調(diào)控擬南芥開花，那么PRP8可能通過參與CRY2相關(guān)的開花調(diào)控途徑。如果PRP8參與CIBs相關(guān)途徑，那么prp8-11突變后，可能通過抑制CRY2降解，積累更多的CRY2蛋白與CIBs轉(zhuǎn)錄因子互作，從而促進下游FT基因的表達；如果PRP8參與COP1/SPAs途徑，那么在prp8-11突變體中，CRY2蛋白過多積累導致下游CO蛋白積累，從而促進擬南芥開花。但目前還不知道PRP8具體參與了哪條CRY2相關(guān)途徑調(diào)控開花，這需要實驗來進一步確定。

CRY1和CRY2具有藍光特異的下胚軸調(diào)控功能，但從本實驗的結(jié)果來看，CRY1的蛋白表達并沒有受到prp8-11突變的影響，PRP8基因可能不是通過CRY1來調(diào)控下胚軸的長度，但prp8-11在藍光下有明顯的下胚軸變短表型，這可能是由于prp8-11屬于功能不完全喪失的弱突變體，對CRY1蛋白的影響沒有被明顯檢測到。CRY2在低藍光下可以抑制下胚軸的伸長，在prp8-11突變體中，CRY2蛋白積累會造成下胚軸明顯變短，推測PRP8可能通過CRY2依賴的途徑來調(diào)控下胚軸的長度。在紅光和遠紅光條件下prp8-11突變體也表現(xiàn)出下胚軸變短表型，所以不排除PRP8通過其他光受體相關(guān)途徑調(diào)控下胚軸長度。PRP8與光信號互作的分子機制還不清楚，所有這些問題都需要進一步研究才能找到答案，這些問題的答案將為進一步了解CRYs及PRP8的作用機制作出貢獻。