倪 楠, 辛志宏, 張麗靜, 王鳳忠*, 李淑英*

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 南京 210095;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室, 北京 100193

納豆激酶是由納豆枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)在一定條件下發(fā)酵合成的一種堿性絲氨酸蛋白酶，具有直接溶解血栓、間接激活機體血栓溶解系統(tǒng)和抑制機體凝血因子等多效溶栓機制。納豆激酶的血栓溶解活力是纖溶酶的4倍[1,2]，是降低血液粘稠度、疏通血管、改善血液循環(huán)和預(yù)防心腦血管疾病極有效的功能因子[3,4]。與目前臨床應(yīng)用的溶栓藥物尿激酶、鏈激酶、纖溶酶原激活劑等相比，具有可以口服、高效快速、特異性強、半衰期長、成本低廉、無毒副作用等優(yōu)點[5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，納豆激酶除了能溶解血栓外，對其他疾病的治療也有潛在作用，例如低血壓和玻璃體視網(wǎng)膜疾病[6]。

當前市場上納豆激酶(nattokinase)的主要來源是納豆，即大豆通過固體發(fā)酵制備的一種即食產(chǎn)品。但是固體發(fā)酵不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和納豆激酶的分離提純。相比而言，液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝簡單、成本低廉且更利于后期納豆激酶的富集純化。因此，研究納豆激酶的液體發(fā)酵工藝顯得尤為必要。而多數(shù)納豆激酶液體發(fā)酵所用培養(yǎng)基碳氮源主要是蛋白胨、牛肉膏及一些化學(xué)試劑[7,8]，存在成本較高且不適于功能性食品開發(fā)的缺陷。目前已有將納豆枯草芽孢桿菌直接接種到食品中進行液體發(fā)酵的研究，例如Kitamura等[9]將納豆枯草芽孢桿菌接種至牛奶中，制備含有納豆激酶的冰激凌產(chǎn)品。吳昱含[10]以豆粕為原料，不僅降低了成本，更是對加工副產(chǎn)品的高效利用。卓曉沁[11]以鷹嘴豆為主要發(fā)酵原料，優(yōu)化了液態(tài)納豆發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件。聶光軍等[12]將豆?jié){和牛奶的混合液作為發(fā)酵培養(yǎng)基，進行氣味和穩(wěn)定性等研究。

本研究以大豆為原料，制備的豆乳為發(fā)酵培養(yǎng)基進行液體發(fā)酵工藝優(yōu)化。首先通過單因素試驗，研究液體發(fā)酵工藝參數(shù)中發(fā)酵時間、裝液量、接菌量和初始pH對納豆激酶活力的影響，確定每個因素的最適計量。再通過正交試驗進行組合優(yōu)化，明確最佳工藝參數(shù)，以期獲得以豆乳為原料生產(chǎn)高活力納豆激酶的工藝條件，為納豆激酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料與試劑 材料：大豆為市售。菌種：納豆枯草芽孢桿菌，實驗室篩選[13]。

試劑：纖維蛋白原(1.0 g)、凝血酶(1 000 U)、尿激酶(10 000 IU/mg，10 mg)均為Sigma公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母提取物均為英國Oxoid公司產(chǎn)品；氯化鈉、氯化鉀、瓊脂粉等均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備 電子分析天平AL204、pH計FE28[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；生化培養(yǎng)箱LRH-250(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；超凈工作臺ZHJH-011128(上海智城分析儀器制造有限公司)；離心機3K15[曦瑪離心機(揚州)有限公司]；生化培養(yǎng)箱LRH-250(常州中成儀器制造)；高壓滅菌鍋GI36T[致微(廈門)儀器有限公司]；恒溫搖床RH-QA(常州中誠儀器制造有限公司)；豆?jié){機RD-808T(合肥榮事達小家電有限公司)。

1.2 方法

1.2.1菌種活化 將-80℃保存的納豆枯草芽孢菌株轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)12 h備用。

1.2.2種子液培養(yǎng) 挑取單菌落，接入20 mL LB液體培養(yǎng)基(50 mL 三角瓶)，37℃ 200 r/min，搖床恒溫培養(yǎng)12 h，取1 mL接入100 mL LB液體培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)，37℃ 200 r/min，搖床恒溫培養(yǎng)12 h備用。

1.2.3發(fā)酵豆乳制作工藝流程 大豆清洗→浸泡(40℃水浴6 h)→瀝干加水煮制豆乳(豆水比1∶8)→接種(菌液)→發(fā)酵→離心取上清→測酶活。

1.2.4尿激酶標準曲線 本試驗應(yīng)用的瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測納豆激酶活力，參照Astrup[14]的方法并加以改進。纖維蛋白平板的制備：稱取1 g瓊脂加到250 mL三角瓶中，量取100 mL PBS(10 mmol/L pH 7.2)緩沖液溶解瓊脂，三角瓶置于微波爐中加熱溶解；待瓊脂冷卻至50℃時向瓶中加入800 μL 50 mg/mL的纖維蛋白原溶液及120 μL 10 U/mL的凝血酶，混合均勻后迅速傾入平皿中；37℃生化培養(yǎng)箱反應(yīng)105 min，以形成纖維蛋白凝塊。

標準曲線的制作：參照奚曉琦[15]的方法。用打孔器打孔，將尿激酶樣品(1 562.5 IU/mL、3 125 IU/mL、6 250 IU/mL、12 500 IU/mL、25 000 IU/mL、50 000 IU/mL)各20 μL點樣于新配置的纖維蛋白平板上，放置10 min后轉(zhuǎn)至37℃生化培養(yǎng)箱反應(yīng)，18 h后取出測定各溶解圈的垂直直徑。上述操作設(shè)定3個平行組，測量后計算溶解圈面積，去除點樣孔面積后，取其平均值為橫坐標。尿激酶標準溶液對應(yīng)的活力，取對數(shù)值為縱坐標，溶解圈面積為橫坐標，制作尿激酶酶活標準曲線。

Y=0.008 2X+2.849 4，線性相關(guān)系數(shù)為0.996 8。

式中，Y表示尿激酶活力的對數(shù)值，X表示溶解圈面積(mm2)。

1.2.5納豆激酶活力測定 取發(fā)酵液樣品15 mL，9 500 r/min離心10 min，將上清液倒入空的離心管中。上清液和沉淀分別稱重，計算出渣率A，上清液作為粗酶液測pH和納豆激酶活力。取待測樣品20 μL，按上述操作上樣、培養(yǎng)、測量溶解圈直徑，計算溶解圈面積，根據(jù)尿激酶標準曲線計算對應(yīng)的納豆激酶活力。出渣率的計算公式為：

式中，A表示出渣率(%)，m表示沉淀質(zhì)量(g)，M表示上清和沉淀總質(zhì)量(g)。

1.2.6單因素試驗 本試驗選取納豆激酶活力、發(fā)酵液出渣率和終點pH作為評價指標，考察因素分別為發(fā)酵時間、裝液量、接菌量和初始pH。

①發(fā)酵時間：以1%的接菌量將種子液接種至初始pH 6.56，100 mL/250 mL的豆乳中，于37℃ 200 r/min的條件下分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h，制備粗酶液，測定酶活力、出渣率和終點pH，確定最佳發(fā)酵時間。

②裝液量：在確定最適發(fā)酵時間的基礎(chǔ)上，在500 mL的三角瓶中分別裝入50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL豆乳，以1%的接菌量將種子液接種至初始pH 6.56的豆乳中，于37℃ 200 r/min的條件下培養(yǎng)至最適發(fā)酵時間，制備粗酶液，測定酶活力、出渣率和終點pH，確定最適裝液量。

③接菌量：在確定最適發(fā)酵時間和裝液量的基礎(chǔ)上，分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的接菌量接菌發(fā)酵，于37℃ 200 r/min的條件下培養(yǎng)，制備粗酶液，測定酶活力、出渣率和終點pH，確定最適接菌量。

④初始pH：在確定的最適發(fā)酵時間、裝液量和接菌量的基礎(chǔ)上，將種子液接至初始pH分別為5、6、7、8、9的豆乳中，于37℃ 200 r/min的條件下培養(yǎng)，制備粗酶液，測定酶活力、出渣率和終點pH，確定最佳初始pH。

1.2.7正交試驗 設(shè)計4因素3水平的正交試驗L9(34)，確定上述4個因素的最佳參數(shù)組合(正交設(shè)計因素水平見表1)。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad 5.0進行作圖和分析；運用正交設(shè)計助手進行正交試驗設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對酶活的影響

發(fā)酵時間對酶活的影響見圖1A，發(fā)酵時間對出渣率和終點pH的影響見圖1B。發(fā)酵時間在12～36 h之間，隨著發(fā)酵時間的增加，納豆激酶的活力持續(xù)上升(P<0.01)，36 h時出現(xiàn)第一個峰；36～60 h之間，隨著發(fā)酵時間的增加，納豆激酶的活力呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.01)；84 h處出現(xiàn)第二個峰；隨后下降。酶活既有上升又有下降趨勢，原因可能為酶在合成的同時也會有部分失活，失活數(shù)小于合成數(shù)則表現(xiàn)為上升趨勢，失活數(shù)大于合成數(shù)則表現(xiàn)為下降趨勢。離心后沉淀中既有豆渣，也有菌體，因此出渣率即反應(yīng)菌體的生長情況，又反應(yīng)菌體對豆渣的利用程度。出渣率隨著時間的增加呈現(xiàn)下降趨勢，菌體理論上會隨著時間的增加而累積，但后期也會存在自溶現(xiàn)象，從整體下降趨勢推測，可能是豆渣被利用導(dǎo)致的。終點pH隨著發(fā)酵時間增加而增加，這與堿性物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，包括納豆激酶和原料分解產(chǎn)物。綜合酶活力和生產(chǎn)成本，選擇36 h作為納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵周期。

2.2 裝液量對酶活的影響

裝液量對酶活的影響見圖2A，裝液量對出渣率和終點pH的影響見圖2B。納豆枯草芽孢桿菌是好氧型細菌，通過改變裝液量可調(diào)節(jié)通氣量。隨著裝液量的增加，納豆激酶活力顯著下降(P<0.01)，出渣率呈現(xiàn)上升趨勢。裝液量越小，通氣量越大，豆乳中溶氧水平就越高，因此產(chǎn)生的納豆激酶活力越高，菌對豆渣的利用率越高，堿性產(chǎn)物積累越多。而裝液量高時，出渣率高的原因可能是此條件下菌體主要利用豆乳進行自身生長繁殖和代謝活動，而沒有開始利用豆渣。因此，確定最佳裝液量為10%。

2.3 接菌量對酶活的影響

接菌量對酶活的影響見圖3A，接菌量對出渣率和終點pH的影響見圖3B。當接菌量為2%時，產(chǎn)酶活力最高；出渣率隨著接菌量的增加呈現(xiàn)先上升后急速下降的趨勢；終點pH隨著接菌量的增加呈現(xiàn)先上升，隨后趨于平緩，最后下降的趨勢。這是由于接菌量較低時，營養(yǎng)物質(zhì)主要供菌體生長，接菌量高時，產(chǎn)生的酶失活率高。以產(chǎn)酶活力為核心指標，因此把接菌量定為2%。

圖1 發(fā)酵時間對納豆激酶活力、出渣率和終點pH的影響Fig.1 The effects of fermentation time on nattokinase activity, slag rate and finial pH.

圖2 裝液量對納豆激酶活力、出渣率和終點pH的影響Fig.2 The effects of liquid loading on nattokinase activity, slag rate and finial pH.

圖3 接菌量對納豆激酶活力、出渣率和終點pH的影響Fig.3 The effects of bacteria loading on nattokinase activity, slag rate and finial pH.

2.4 初始pH對酶活的影響

初始pH對酶活的影響見圖4A，初始pH對出渣率和終點pH的影響見圖4B。菌體生長過程中pH主要通過影響菌體細胞膜電荷、膜滲透性及營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。pH超過6后納豆激酶活力呈現(xiàn)下降趨勢，表明納豆枯草芽孢桿菌適宜產(chǎn)酶的初始條件為中性偏酸，而堿性條件下不適合納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶。酶活最高點所對應(yīng)的終點pH也最高，出渣率最低，表明在此條件下菌體生長旺盛，酶的表達量最高。因此初始pH定為6。

圖4 初始pH對納豆激酶活力、出渣率和終點pH的影響Fig.4 The effects of initial pH on nattokinase activity, slag rate and finial pH.

2.5 正交試驗

上述單因素試驗結(jié)果表明，發(fā)酵時間、裝液量、接菌量和初始pH對發(fā)酵液酶活有較大影響。由于上述幾個因素間可能存在交互作用，故設(shè)計正交試驗以確定其最適發(fā)酵條件。表2為正交試驗結(jié)果。正交試驗表明，4個因素對納豆激酶活力的影響主次順序為裝液量>發(fā)酵時間>接菌量>初始pH。理論優(yōu)化方案為A1B1C3D1，即發(fā)酵時間30 h，裝液量5%，接菌量2.25%，初始pH 5.5。正交試驗表中無此理論配方，配方1與理論配方最接近。為了考察理論配方與實際配方，需進行驗證試驗。

2.6 驗證試驗

將理論配方(A1B1C3D1)和實際配方(A1B1C1D1)進行產(chǎn)酶活力驗證，理論配方酶活為120 414.85 IU/mL，實際配方酶活為429 869.34 IU/mL，與正交試驗結(jié)果(454 518.18 IU/mL)接近，說明數(shù)據(jù)可信。但理論酶活與實際酶活相差較大，條件不同之處在于接菌量。理論配方(A1B1C3D1)接菌量大于實際配方(A1B1C1D1)，酶活力遠小于實際配方，說明接菌量過大不利于產(chǎn)酶。因此，最優(yōu)組合確定為發(fā)酵時間30 h，裝液量5%，接菌量1.75%，初始pH 5.5，該條件下納豆激酶活力為429 869.34 IU/mL，是優(yōu)化前(79 434.68 IU/mL)的5.41倍。

表2 正交試驗結(jié)果表Table 2 Results of the orthogonal test.

3 討論

本試驗中，以納豆激酶活力為核心評價指標，以出渣率和終點pH為輔助評價指標，通過單因素及正交試驗法，優(yōu)化了以豆乳為發(fā)酵基質(zhì)的納豆激酶液體發(fā)酵條件。

本試驗為今后納豆激酶功能食品的開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)，進一步擴大實驗規(guī)模是下一步努力的方向，擬采用發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，實現(xiàn)從實驗室到生產(chǎn)線的過渡。同時，后期發(fā)酵豆乳風味的改良、納豆激酶功能食品開發(fā)、生產(chǎn)工藝的完善等也將是我們重點關(guān)注的方向。