杜澍金 綜述，高維娟 審校

(河北中醫(yī)學院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，石家莊 050200)

缺血缺氧性腦血管疾病是臨床常見病、多發(fā)病，其致死率、致殘率和復發(fā)率極高[1]。隨著現(xiàn)代化的進展，人類飲食結構和生活方式的改變，使得腦缺血缺氧性疾病發(fā)病率迅速增長，嚴重威脅人類的健康及生活質量?！?018版中國缺血性腦卒中診治指南》顯示，每年發(fā)生腦卒中、腦卒中相關死亡和腦卒中的全球總負擔的絕對數(shù)量巨大，而且持續(xù)增加，腦卒中已成為我國城市和農村人口第一位致殘和死亡原因，其中缺血性腦卒中占70%。因此，降低缺血性腦血管疾病的發(fā)病率、致殘率和致死率已成為目前亟待解決的臨床問題。

黃芪具有補氣升陽、利水消腫、行滯通痹等功效，用于治療缺血性腦血管病已有2 000多年歷史，其主要的活性成分之一為黃芪甲苷[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護作用[3]。其他研究也發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷在心、腦、腎、胃、肺等多種器官和組織的缺血及再灌注損傷中發(fā)揮作用，其機制與黃芪甲苷對內皮細胞的保護作用有關。因此，本文就黃芪甲苷對血管內皮及其連接的保護作用進行綜述，為進一步發(fā)掘黃芪甲苷的作用及其對缺血缺氧性腦血管疾病的防治提供參考。

1 缺血缺氧對腦血管內皮的損傷

腦血管內皮細胞是內覆于血管腔表面的連續(xù)單層扁平細胞，構成血液和組織細胞間的半通透性屏障，維持血管壁通透性和液體平衡。內皮細胞彼此重疊覆蓋，借由內皮間連接形成連續(xù)性結構，并與細胞外基質和星形膠質細胞腳板等共同構成血腦屏障，使腦組織免受循環(huán)中有害物質的損害，保持內環(huán)境的相對恒定，對維持中樞神經系統(tǒng)功能具有重要意義。此外，血管內皮細胞還可分泌多種血管活性物質，維持血管壁張力、血流動力學、血管新生和纖維基質增生，同時還可參與炎性反應和免疫調節(jié)等生理病理過程[4-6]。

血管內皮易受多種因素的影響，如缺血缺氧等刺激均可致血管內皮損傷和凋亡、內皮間緊密連接蛋白表達下降及細胞外基質合成減少或降解增多，進而破壞血腦屏障結構的完整性，導致組織間隙液體積聚、信號傳導通路障礙、內皮分泌功能受損、血管損傷、血栓生成等，破壞腦組織內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、損傷組織細胞，引起腦功能的減退甚至喪失。由此可見，血管內皮功能的損害是多種心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的共同病理生理基礎，防治腦血管內皮的損傷也就成為治療這些疾病的關鍵。

2 黃芪甲苷對缺血缺氧性腦血管內皮損傷的保護作用

血管內皮細胞之間黏附連接、緊密連接、縫隙連接和橋粒連接，與細胞外基質和內皮細胞表達的整合素形成的基膜共同構成血管內皮屏障，尤其是內皮間黏附連接和緊密連接在保護腦組織免受缺血缺氧性損害中起重要作用。有研究顯示，黃芪甲苷可以通過抑制內皮細胞的凋亡、炎癥，促進內皮細胞的增殖和遷移，促進細胞間連接蛋白的表達，參與血管重構和新生，進而發(fā)揮對血管內皮的保護作用，抑制或減輕其凋亡和損傷，保護內皮屏障結構和功能的完整性，減輕缺血缺氧性腦損傷。

2.1黃芪甲苷抑制缺血缺氧性腦血管內皮損傷和凋亡 腦血管內皮細胞直接與循環(huán)血液接觸，易受血液中的各種有毒有害物質的損害，而致其屏障結構和內分泌功能的破壞，進而參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。如缺血缺氧引起的腦血管內皮損傷可以引起腦血腫，加重腦組織缺血缺氧性損傷，如此又進一步引起炎癥因子的釋放，形成惡性循環(huán)，逐步加重腦損傷進程。因此，減輕腦內皮細胞的損傷和凋亡是維持腦血管壁完整和促進新生血管重建的關鍵。

2.1.1黃芪甲苷抑制腦血管內皮細胞凋亡 有關黃芪甲苷藥物作用的研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過阻止procaspase-8斷裂，下調促凋亡蛋白Bax和p53表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達，減少細胞線粒體Cyto C的釋放，抑制caspase-3的活性來發(fā)揮抗凋亡作用。崔偉等[6]通過建立過氧化氫誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷細胞模型，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可降低氧化應激導致的內皮細胞凋亡率，其保護血管內皮的機制可能為黃芪甲苷激活PI3K/Akt信號通路抑制內皮細胞內質網應激有關。黃芪甲苷可以通過激活低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)，抑制缺氧誘導的內皮細胞凋亡[5]。還有研究表明黃芪、川芎的有效成分配伍對SD 乳鼠腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cell,BMVEC)缺氧損傷有顯著的保護作用，其機制可能與保護細胞膜穩(wěn)定性，提高氧自由基清除能力，抑制細胞凋亡有關[7]。黃芪甲苷可通過抗氧化應激作用，緩解內皮損傷[8]，通過內質網應激機制抑制炎性反應而減少凋亡[9]。另外，黃芪甲苷可抑制血管內皮損傷后細胞及內膜過度增生，進而避免損傷后血管腔狹窄的出現(xiàn)，防止供血區(qū)域組織的缺血缺氧。

由此可見，黃芪甲苷可以通過多種途徑抑制內皮細胞凋亡的發(fā)生，從而保護內皮屏障，減輕循環(huán)中有害物質對組織器官的損傷作用。

2.1.2黃芪甲苷上調血管內皮生長因子(VEGF)表達，促進腦血管內皮細胞增殖 王歡等[10]在體外實驗證明，黃芪甲苷與當歸以3∶1的比例，且總濃度為2 μg/mL時，可通過促進細胞增殖來促進血管的生成，其機制可能與VEGF有關。

有關腦缺血及缺血再灌注的研究發(fā)現(xiàn)，在腦組織缺血缺氧時VEGF分泌增多，可以促進血管內皮細胞增生，誘導血管生成，減輕腦水腫，緩解腦組織損傷[11]。VEGF是體內誘導血管新生的重要生長因子，主要通過與血管內皮細胞上的VEGF受體特異性結合來發(fā)揮作用[12]。因此，研究腦缺血時黃芪甲苷對VEGF的調節(jié)作用，將對缺血性腦血管病的治療帶來新的前景。

李軍昌等[4]通過實驗證明，黃芪甲苷可通過穩(wěn)定梗死組織HIF-1和VEGF的表達，促進血管內皮細胞的增殖及體外實驗中離體管腔的形成，促使血管新生和成熟，并形成有效灌注功能的微血管，改善組織血供和氧供。通過缺氧誘導HUVECs損傷后，給予川芎嗪與黃芪甲苷干預可以上調VEGF的表達、減輕內皮損傷[13]。可見，黃芪甲苷可以通過對VEGF的調節(jié)發(fā)揮其抗缺血缺氧性血管內皮損傷和促血管新生作用，進而維持血管內皮屏障的功能和結構完整性。

2.2黃芪甲苷通過上調血管內皮間連接蛋白表達，保護腦血管內皮屏障 內皮間連接，尤其是黏附連接和緊密連接在血管內皮屏障功能中起重要作用。在致傷因素影響下，保護連接蛋白免受損傷或促使其表達上調，對內皮屏障功能的維持有重要作用。用藥物誘導單層HUVECs間連接蛋白VE-cadherin 和緊密連接蛋白ZO-1、咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白家族(Claudins)-5的基因和蛋白表達的明顯下降后可致細胞連接松散、斷裂，結構不完整，血管內皮屏障功能障礙[14]。研究證明，黃芪甲苷可以上調內皮間連接蛋白的表達以維持內皮屏障功能的穩(wěn)定。

2.2.1黃芪甲苷促進腦血管內皮間緊密連接蛋白表達 毛細血管內皮之間的緊密連接是血腦屏障結構和功能的基礎，內皮間緊密連接蛋白的缺失導致血腦屏障的破壞，進而引起血管源性腦水腫。緊密連接主要由Occludin、Claudins、JAM家族蛋白及閉環(huán)蛋白等組成，其中跨膜蛋白Claudins和Occludin是形成緊密連接屏障的主要結構。

Claudins可與閉合蛋白結合調控內皮細胞間的黏附、極性及屏障功能，還可參與細胞外基質的降解。其中Claudin-5是BMVEC緊密連接中的特異性蛋白，其外源性表達可誘導血腦屏障的形成，而缺血缺氧可導致其分布的連續(xù)性和表達量明顯降低或者磷酸化增多，引起腦血管內皮細胞通透性增高。ASLAM等[15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)能下調Claudin-5的表達而損傷大鼠BMVEC的緊密連接。而黃芪甲苷可以明顯降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織炎癥因子TNF-α的表達水平[16]。因此，推測黃芪甲苷通過下調TNF-α的表達間接上調Claudin-5蛋白，以維持緊密連接結構和功能的完整。

Occludin是內皮細胞封閉細胞間隙的主要成分，是緊密連接的基礎結構。在腦缺血或氧化劑誘導血腦屏障功能損害的研究中發(fā)現(xiàn)，Occludin表達量減少，磷酸化增加，在細胞中的位置分布和結構發(fā)生改變。曲友直等[17]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可通過上調Occludin的表達，維持緊密連接復合體結構的完整性，抑制缺血再灌注引起的血腦屏障的破壞。

閉環(huán)蛋白是緊密連接的膜周邊蛋白，可部分調節(jié)、穩(wěn)定內皮細胞的漿膜層。其中閉鎖小帶蛋白-1可以通過調節(jié)緊密連接和黏附連接蛋白的相互作用來改變內皮的通透性，其功能和結構的改變可導致緊密連接解離、細胞間隙增大、血管通透性升高。黃芪甲苷可以通過上調 Occludin及閉鎖小帶蛋白-1的表達，維持內皮緊密連接的穩(wěn)定性，進而抑制內皮屏障的破壞，對抗腦缺血再灌注導致的腦水腫[18]。

2.2.2黃芪甲苷增強腦血管內皮間縫隙連接蛋白表達 縫隙連接由亞基蛋白Connexins(Cx)形成，控制著水和離子的運輸。研究顯示，Cx43的表達增加可以進一步加重炎癥因子所誘導的血管通透性的增加[19]。CHU等[20]配伍使用芍藥花甙和黃芪甲苷可以減輕缺血所致腦水腫，機制與下調Cx43蛋白表達密切相關。黃芪甲苷可以逆轉梗死組織中Cx43蛋白表達減少和分布紊亂，其機制可能與抗氧化作用有關[21]。由此可知，黃芪甲苷可以通過促進縫隙連接蛋白的表達減輕缺血缺氧對血管內皮屏障的損傷。

2.3黃芪甲苷通過抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)維持腦血管內皮屏障的穩(wěn)定性 在正常狀態(tài)下，細胞外基質成分的合成和降解保持動態(tài)平衡，主要由MMPs調控。MMPs生理情況下主要以無活性的酶原形式存在；在病理狀態(tài)下通過降解毛細血管基底膜的某些基質蛋白，導致血管的完整性受到破壞，通透性增加，介導血管源性腦水腫的發(fā)生，其中起主要作用的是明膠酶A(MMP-2)和明膠酶B(MMP-9)。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9對血管內皮細胞胞外基質和血管基底膜的損傷機制與降解毛細血管基底膜Ⅳ型膠原和層黏蛋白等成分，激活核因子(NF)-κB細胞信號轉導通路下調細胞間緊密連接蛋白的表達相關，最終導致毛細血管通透性增加。此外，MMPs可導致Claudin-5和Occludin連續(xù)性及穩(wěn)定性的變化，破壞緊密連接，使血管壁通透性增加，應用MMPs抑制劑可以抑制其介導的Claudin-5和Occludin連續(xù)性及穩(wěn)定性的變化，從而保持緊密連接的完整性[14]。

研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可明顯下調缺血再灌注后腦組織MMP-9蛋白的高表達，減少細胞外基質的降解，保護血管壁結構和功能的穩(wěn)定，減輕血管源性腦水腫[22]。LI等[23]證明腹腔注射黃芪甲苷可明顯降低大腦中動脈閉塞/再灌注模型MMP-9表達，維持血腦屏障結構完整性，有效減輕腦水腫程度?？梢姡S芪甲苷可以通過上調MMP-9的表達來保護腦缺血/再灌注動物模型血管內皮屏障的穩(wěn)定性。

2.4黃芪甲苷抑制缺血缺氧性腦血管內皮細胞炎性反應 血管內皮損傷是缺血再灌注損傷的關鍵環(huán)節(jié)。再灌注時產生大量氧自由基使內皮細胞激活并表達多種炎癥因子，導致細胞的損傷、凋亡和壞死?；罨膬绕ぜ毎砻姹磉_黏附分子-1，與相應配體結合后介導白細胞與血管壁的黏附過程，啟動白細胞的趨化作用，導致血管通透性的增高及血管狹窄，進而引起組織水腫等。抑制NF-κB的活性可以下調黏附分子的表達，抑制其介導的炎性反應。研究發(fā)現(xiàn)，經黃芪甲苷處理后，培養(yǎng)的HUVECs表達NF-κB減少，細胞培養(yǎng)液中黏附分子-1濃度降低，這表明黃芪甲苷可以通過下調炎癥因子NF-κB、黏附分子等的表達保護血管內皮免受缺氧等刺激的損傷[24]。因此，黃芪甲苷清除氧自由基引起的脂質過氧化作用，在一定程度上避免了氧自由基對血管內皮的直接損傷及其誘發(fā)的炎性反應對血管內皮的損傷。

魏冰等[25]實驗證明ox-LDL可以誘導內皮細胞局部炎性反應，而在內皮細胞培養(yǎng)液中加入黃芪甲苷后，細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-8、細胞間黏附分子-1等的表達下降，證明黃芪甲苷發(fā)揮了良好的抗炎作用。崔偉等[6]的研究也發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過抑制TNF-α和IL-6的表達減輕H2O2誘導的HUVECs炎性反應。有研究證實，腦缺血再灌注損傷可誘導NLRP3炎癥小體在血管內皮細胞中的活化和表達增強，并通過下游IL-1β、IL-18等加重腦損傷，而給予腦缺血再灌注損傷大鼠黃芪甲苷灌胃后，炎癥因子NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18 和 IL-18 水平均明顯降低。有其他實驗證明黃芪甲苷可通過調節(jié)多種炎癥因子的表達，降低培養(yǎng)細胞及在體組織的炎性反應。

3 展 望

缺血缺氧性腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)與內皮的損傷及內皮屏障的破壞密切相關。黃芪的主要活性成分黃芪甲苷可以通過抑制內皮細胞凋亡，促進內皮細胞的增殖和遷移、細胞間連接蛋白的表達和調節(jié)內皮細胞的分泌功能來保護血管內皮功能，維持血管內皮屏障功能和促進血管再生，其機制涉及MAPK、ERK、PI3K/Akt等信號通路，與多種受體、細胞因子、生長因子等相關。此外，黃芪甲苷還對神經元的損傷及星形膠質細胞的激活有調節(jié)作用。因此，深入研究黃芪甲苷對于血管內皮的保護作用靶點和其機制，以及對神經元、膠質細胞等的保護作用機制，將對于人類健康和心腦血管疾病的治療和預防有重要價值。