陸運(yùn)鑫 唐偉智 侯恩存

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科，南寧市 530011，電子郵箱yunxinlu99@163.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530001)

在我國(guó)，原發(fā)性肝癌的患病率在惡性腫瘤中僅次于肺癌、胃癌，且死亡率逐漸上升，僅次于肺癌，對(duì)人們的健康和生命造成極大威脅[1-2]。目前，原發(fā)性肝癌的主要治療方法有肝切除術(shù)、肝移植、介入治療、放化療、生物靶向治療等[3]，而中藥治療肝癌在我國(guó)具有較長(zhǎng)的歷史，并且具有多方、多靶點(diǎn)、不易耐藥等優(yōu)勢(shì)[4]，其治法主要有扶正去邪、疏肝健脾、解毒化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等[5]。

消積化瘀丸由炙黃芪、黨參、鹿角膠、菟絲子、山慈菇、全蝎、蜈蚣、守宮、土鱉蟲(chóng)、三七、蛇六谷、生牡蠣、鱉甲、炮山甲組成，具有扶正清毒、化瘀消積的作用。該方可提高免疫力，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減少?gòu)?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，可用于非小細(xì)胞肺癌、肝癌的治療[6-7]。但消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌的活性成分和作用機(jī)制仍未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的原理是基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)、綜合地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的影響，從而揭示藥物協(xié)同作用于人體的規(guī)律。該研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)，與中醫(yī)學(xué)從整體的角度診治疾病的理論，以及中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸[8]。本研究將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討消積化瘀丸多種藥物的主要活性成分及其治療原發(fā)性肝癌的機(jī)制，為消積化淤丸的臨床使用提供參考。

1 資料與方法

1.1 消積化瘀丸活性成分的篩選 消積化瘀丸由黃芪、黨參、鹿角膠、菟絲子、山慈菇、蛇六谷、全蝎、蜈蚣、守宮、土鱉蟲(chóng)、三七、牡蠣、鱉甲、炮山甲等14味中藥組成，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php )[9]、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[10]、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)[11]收集這14味中藥活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，參照文獻(xiàn)[12]，設(shè)定生物利用度≥30%和類藥性≥0. 18，篩選出符合條件的活性成分，并將多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的活性成分進(jìn)行合并去除重復(fù)。

1.2 中藥活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)PharmMapper平臺(tái)(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php)[13]查詢活性成分的作用靶點(diǎn)信息，同時(shí)剔除非人源靶點(diǎn)。將活性成分的分子結(jié)構(gòu)以mol2格式上傳到PharmMapper平臺(tái)服務(wù)器，設(shè)定返回靶點(diǎn)數(shù)為300，并選擇藥效團(tuán)模型作為設(shè)定條件，提交后由該平臺(tái)完成活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)。提取對(duì)接分?jǐn)?shù)較高的前30個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)校正和轉(zhuǎn)換，得到活性成分作用的人源相關(guān)蛋白靶點(diǎn)。將收集到的中藥活性成分以及預(yù)測(cè)的成分靶點(diǎn)蛋白通過(guò)Cytoscape軟件制作成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白的收集 通過(guò)PubMed MeSH數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)獲取原發(fā)性肝癌的關(guān)鍵詞，主要有l(wèi)iver neoplasm、hepatocellular cancer、cancer of the liver。通過(guò)檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)[14]、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[15]、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)獲得原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白，并將各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白合并去重。

1.4 消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為探究消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制，利用在1.2和1.3中分別收集到的人源相關(guān)靶點(diǎn)蛋白及原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白，通過(guò)VennDiagram平臺(tái)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作文氏圖，獲得相互交集的靶蛋白。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，針對(duì)消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌靶蛋白構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction ,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape軟件將網(wǎng)絡(luò)圖可視化[16-17]。

1.5 消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)的富集分析與通路分析 通過(guò)DAVID在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析。GO分析中選擇生物進(jìn)程、分子功能及細(xì)胞組分3項(xiàng)內(nèi)容繪制條形圖。通過(guò)KEGG Mapper平臺(tái)(https://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)查找富集出來(lái)的生物通路圖，并利用 OmicShare(https://www.omicshare.com/)將得到的通路分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 消積化瘀丸14種中藥的活性成分 共收集到黨參21個(gè)成分、黃芪20個(gè)成分、三七6個(gè)成分、山慈菇3個(gè)成分、菟絲子8個(gè)成分、蛇六谷(魔芋)1個(gè)成分、鱉甲1個(gè)成分、鹿角膠2個(gè)成分、炮山甲2個(gè)成分、全蝎7個(gè)成分、牡蠣6個(gè)成分、壁虎(守宮)2個(gè)成分、土鱉蟲(chóng)(蟄蟲(chóng))1個(gè)成分、蜈蚣7個(gè)成分，見(jiàn)表1。

表1 消積化瘀丸14種中藥的活性成分

2.2 藥物活性成分的靶點(diǎn)及原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白 進(jìn)一步通過(guò)PharmMapper平臺(tái)反向分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，得到藥物活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，選取每個(gè)成分得分最高的前 30個(gè)靶點(diǎn)蛋白，經(jīng)過(guò)校正，并剔除重復(fù)及非人源靶點(diǎn)后，得出消積化瘀丸的作用靶點(diǎn)共368個(gè)；在成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，對(duì)796個(gè)靶蛋白節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有80個(gè)靶蛋白具有10個(gè)以上相互作用的活性分子，其中度值較高的主要有硬脂酸、異黃酮、苦參堿。通過(guò)OMIM、TTD、CTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白，合并去重后獲得32935個(gè)肝癌相關(guān)蛋白。

2.3 消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)制作文氏圖獲得消積化瘀丸活性成分靶點(diǎn)與原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白交集的靶蛋白365個(gè)，建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖1)，該網(wǎng)絡(luò)包含328個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 120條相互作用關(guān)系，應(yīng)用Cytoscape軟件插件NetworkAnalyzer進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)主要有腫瘤抑制蛋白p53、蛋白激酶B1、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白、絲裂原活化蛋白激酶3、絲裂原活化蛋白激酶1，其中度值最高的是腫瘤抑制蛋白 p53。

圖1 消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌靶蛋白的GO富集分析 為更進(jìn)一步了解候選靶點(diǎn)的作用機(jī)制，通過(guò)DAVID在線分析工具對(duì)消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌的365個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，制作消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)的GO富集分析中生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成排名前20的條狀圖(見(jiàn)圖2)。在生物進(jìn)程中，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、對(duì)藥物反應(yīng)、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控排位靠前；在細(xì)胞組成中，細(xì)胞質(zhì)、胞漿、漿膜排位靠前；在分子功能中，三磷酸腺苷結(jié)合、蛋白質(zhì)均聚活性、同一蛋白結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合排位靠前。

2.5 消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌靶蛋白的通路分析 使用DAVID在線分析工具對(duì)消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌的365個(gè)靶蛋白進(jìn)行通路分析，制作20個(gè)富集靶蛋白數(shù)量最多的通路的氣泡圖(見(jiàn)圖3)，顏色從綠色到紅色反映了P值從大到小，節(jié)點(diǎn)從小到大反映了靶蛋白相關(guān)聯(lián)的富集基因數(shù)量從少到多，其中富集因子值越大，其富集的程度越大。結(jié)果顯示，消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌的靶點(diǎn)主要富集于氨酰tRNA生物合成信號(hào)通路，精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路。

靶蛋白(個(gè))

靶蛋白(個(gè))

靶蛋白(個(gè))

富集因子

圖3 消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌靶點(diǎn)的通路富集分析氣泡圖

3 討 論

肝癌在中醫(yī)歸類為“積聚”“痞氣”“瘕積”等疾病范疇，王文志等[18]認(rèn)為，正氣不足導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，邪毒內(nèi)生，引起氣滯血瘀、脈絡(luò)閉阻是其內(nèi)因；飲食不節(jié)、情志失調(diào)、外感邪氣是其外因，內(nèi)外因相結(jié)合，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。消積化瘀丸便是以扶正清毒、化瘀消積為治法，輔助治療原發(fā)性肝癌。臨床研究表明，消積化瘀丸聯(lián)合經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)或聯(lián)合射波刀治療原發(fā)性肝癌，均取得了顯著的療效[6,19]。

韓明等[20]通過(guò)研究觀察壁虎活性單體衍生物腺嘌呤發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤可顯著地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。壁虎(守宮)是消積化瘀丸組成藥物之一，而本研究結(jié)果顯示腺嘌呤為消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌的主要活性成分之一。此外，消積化瘀丸中的主要活性成分還有硬脂酸、異黃酮、苦參堿，主要存在于炮山甲、黃芪、菟絲子中。研究表明，硬脂酸治療肝毒性有益[21]；異黃酮屬于黃酮類化合物，其對(duì)大鼠肝癌 CBRH-7919 細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[22]；苦參堿在抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)中也發(fā)揮重要作用[23]。

本研究中，消積化瘀丸作用于原發(fā)性肝癌的靶蛋白主要有腫瘤蛋白p53、蛋白激酶B1、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白、絲裂原活化蛋白激酶3、絲裂原活化蛋白激酶1。研究表明[24]，腫瘤抑制因子p53的作用涉及細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、衰老和新陳代謝；蛋白激酶B則通過(guò)磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[25]；絲裂原活化蛋白激酶3、絲裂原活化蛋白激酶1可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化[26]；核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白為細(xì)胞核內(nèi)重要的癌蛋白，其表達(dá)隨著肝癌惡性程度的增高、分化程度的降低而升高[27]。作用于上述靶蛋白的成分有腺嘌呤、5′-羥基異丁香酚-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、組氨酸，分別主要存在于守宮、黃芪、蜈蚣中。

通路富集分析氣泡圖顯示，消積化瘀丸治療原發(fā)性肝癌涉及的通路主要有氨酰tRNA生物合成信號(hào)通路，精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路。參與氨酰tRNA生物合成信號(hào)通路的為消積化瘀丸組成中蜈蚣的活性成分亮氨酸、酪氨酸、組氨酸；參與精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路的為菟絲子的活性成分芝麻素，黨參的活性成分蒲公英酚，蜈蚣的活性成分亮氨酸、組胺和守宮的活性成分腺嘌呤。有研究表明，氨酰tRNA生物合成信號(hào)通路中的p43因子影響細(xì)胞凋亡、血管生成、細(xì)胞分化等，而另外兩種輔助因子p38和p18，分別可以抑制癌基因c-myc 的表達(dá)和參與DNA損傷修復(fù)中重要的共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia telangiectasia-mutated gene， ATM)、ATM與Rod 3相關(guān)蛋白激酶-p53通路[28]。精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路主要調(diào)控脯氨酸和L-精氨酸的表達(dá)，Roger等[29]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸水平升高，可改善T細(xì)胞存活、延長(zhǎng)真核生物壽命、調(diào)節(jié)抗腫瘤活性等；而脯氨酸是一個(gè)重要的細(xì)胞代謝和生理調(diào)節(jié)劑，影響著人類和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)[30]。另外，消積化瘀丸組成中守宮、蜈蚣、牡蠣、黃芪、炮山甲、全蝎、土鱉蟲(chóng)、三七、菟絲子均調(diào)控了常見(jiàn)的腫瘤經(jīng)典通路絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路。

綜上所述，消積化瘀丸可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、血管生成、細(xì)胞分化、抑制癌基因表達(dá)等過(guò)程發(fā)揮多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同抗腫瘤作用。但由于遺漏一些活性成分以及對(duì)關(guān)鍵成分的認(rèn)識(shí)不足等，本研究尚有一定的局限性。