(武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院,湖北武漢 430205)

宣恩火腿是我國(guó)湖北省恩施自治州一帶特產(chǎn),以宣恩縣所產(chǎn)火腿最負(fù)盛名,其肉質(zhì)細(xì)嫩,皮黃脂白肉紅,氣味鮮香宜人,滋味濃郁[1],在乾隆時(shí)期就作為貢品進(jìn)貢朝廷,被譽(yù)為“中國(guó)四大名腿”之一[2]。

風(fēng)味是判別火腿品質(zhì)的重要指標(biāo),火腿獨(dú)特的風(fēng)味主要來源于脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶和環(huán)境微生物產(chǎn)生的外源酶雙重作用下形成的各種風(fēng)味物質(zhì)[3],包括醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、烷烯烴類以及含氧、氮、硫的雜環(huán)化合物等[4-5]。蛋白質(zhì)在火腿生產(chǎn)過程中降解產(chǎn)生低分子量的氨基酸、肽、有機(jī)酸等物質(zhì),這些物質(zhì)有的直接產(chǎn)生風(fēng)味,有的是風(fēng)味前體物質(zhì)[6],其中游離氨基酸和小分子肽又經(jīng)過美拉德反應(yīng)和斯托克斯降解,生成了一些具有揮發(fā)性的風(fēng)味物質(zhì)[7]?；鹜鹊鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)變化包括肽主鏈的斷裂、分子間二硫鍵的形成以及氨基酸殘基側(cè)鏈的羰基化等[8]。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化,蛋白質(zhì)組成也發(fā)生了變化,大分子物質(zhì)種類和含量逐漸減少,這種變化主要是組織蛋白酶引起的[9]。這些變化對(duì)火腿品質(zhì)產(chǎn)生有利或不利的影響,有利的影響是使火腿形成特有的風(fēng)味,如金華火腿游離氨基酸比鮮腿高出15倍,谷氨酸含量高出60倍[10],游離氨基酸進(jìn)一步反應(yīng)生成揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),如醇、酯、酮等[11],這些物質(zhì)共同構(gòu)成了干腌火腿的特有風(fēng)味。不利影響主要體現(xiàn)在豬肉流變學(xué)特性、凝膠特性變差,導(dǎo)致火腿品質(zhì)下降[12]。

目前對(duì)金華火腿和宣威火腿蛋白質(zhì)降解規(guī)律及對(duì)風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)研究比較清晰[13-14],關(guān)于宣恩火腿蛋白質(zhì)的降解規(guī)律研究比較滯后。本課題擬研究宣恩火腿不同加工階段蛋白質(zhì)降解規(guī)律,為探究宣恩火腿品質(zhì)及風(fēng)味形成研究提供基礎(chǔ),研究成果可為宣恩火腿的現(xiàn)代化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用火腿 由湖北省思樂牧業(yè)集團(tuán)有限公司提供,每個(gè)階段采集三支火腿,取股二頭肌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象;本課題研究五個(gè)階段的樣品 分別為原料腿、腌制期、發(fā)酵初期、發(fā)酵中期和成品腿,原料腿指用于生產(chǎn)制作宣恩火腿的新鮮豬腿(恩施本地黑豬),腌制期指腌制1個(gè)月的豬腿(用鹽量為每10 kg豬腿用鹽1 kg,分6～7次上鹽),發(fā)酵初期指發(fā)酵1個(gè)月的豬腿,發(fā)酵中期指發(fā)酵4個(gè)月的豬腿,成品腿指發(fā)酵7個(gè)月后經(jīng)洗霉修割的豬腿;氫氧化鈉、甲醛、茚三酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鉀、硫酸銅、氯化鉀、氯化鈉、硼酸、三氯乙酸、碳酸鉀、碳酸鈉、乙醇、牛血清蛋白、福林酚試劑、溴甲酚綠、氧化鎂 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸、鹽酸 分析純,平煤神馬集團(tuán)開封東大化工有限公司試劑廠。

FE20型pH計(jì) 瑞士Metteler toledo公司;UV2000型分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司;AL-104型分析天平 瑞士Metteler toledo公司;JY600型蛋白質(zhì)電泳儀 北京六一儀器廠;K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀 江南海能儀器股份有限公司;Neofuge 18R型高速冷凍離心機(jī) 香港Heal Force公司;8900型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 宣恩火腿簡(jiǎn)要工藝流程 選腿→修胚→腌制→洗腿→整形→烘腿→入庫(kù)發(fā)酵→洗霉→修割→驗(yàn)收[15]。

1.2.2 蛋白質(zhì)組成的測(cè)定 各火腿樣品中不同類型蛋白質(zhì)提取方法見圖1,對(duì)提取的蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測(cè)定氮含量,具體參照GB 5009.5-2016。

圖1 各蛋白質(zhì)提取步驟Fig.1 Extraction steps of each protein注:A液含15.6 mmol/L磷酸氫二鈉,3.5 mmol/L磷酸二氫鉀,pH7.5;B液含0.5 mol/L氯化鉀,15.6 mmol/L磷酸氫二鈉,3.5 mmol/L磷酸二氫鉀,pH7.5;C液為0.1 mol/L氫氧化鈉。

1.2.3 蛋白質(zhì)水解指數(shù) 非蛋白氮占總氮的比例即為蛋白質(zhì)水解指數(shù)。

1.2.4 多肽氮的測(cè)定 參照胡亞亞等[16]的方法提取樣品多肽,參照方細(xì)娟[17]的方法測(cè)定多肽含量并換算成多肽氮含量。

1.2.5 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定 氨基酸態(tài)氮含量采用酸度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定,具體參照GB 5009.235-2016。

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定 揮發(fā)性鹽基氮含量采用半微量定氮法進(jìn)行測(cè)定,具體參照GB 5009.228-2016。

1.2.7 pH的測(cè)定 稱取10.00 g均勻的樣品于250 mL的錐形瓶中,加入100 mL無二氧化碳蒸餾水,浸泡15 min,并隨時(shí)搖動(dòng),過濾后取濾液用pH計(jì)測(cè)定pH。

1.2.8 游離氨基酸組成的測(cè)定 氨基酸組成采用自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定,具體參照GB 5009.124-2016。

1.2.9 蛋白質(zhì)電泳 將1.2.2中提取的四種蛋白進(jìn)行電泳分析。分離膠丙烯酰胺濃度12%,濃縮膠濃度5%,樣品緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl。電泳前將樣品和樣品緩沖液煮沸5 min,取10 μL上清液進(jìn)行點(diǎn)樣。凝膠電泳于恒流進(jìn)行,在濃縮膠時(shí)電壓為85 V,進(jìn)入分離膠時(shí)電壓為125 V,最后染色、脫色、照膠。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次,取平均值,采用SAS 9.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣恩火腿加工過程中非蛋白氮變化

2.1.1 非蛋白氮含量變化 非蛋白氮主要包括多肽氮、氨基酸態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮、核酸氮等,火腿非蛋白氮主要包括多肽氮和氨基酸態(tài)氮,大約占非蛋白氮的70%～80%[18]。

從表1可以看出,宣恩火腿在加工過程中總氮在經(jīng)過腌制期時(shí)含量顯著下降(P<0.05),隨后保持穩(wěn)定,腌制期大量的鹽分進(jìn)入導(dǎo)致滲透壓升高,細(xì)胞破裂,汁液流失,導(dǎo)致少量蛋白質(zhì)損失。非蛋白氮含量在整個(gè)加工過程中持續(xù)上升,從原料腿中的685.9 mg/100 g增加到成品的1724.3 mg/100 g,其含量的增加主要來源于蛋白的降解。從蛋白質(zhì)水解指數(shù)可以看出,發(fā)酵階段蛋白質(zhì)水解指數(shù)上升幅度較快,表明此階段蛋白質(zhì)分解速度較快。Careri等報(bào)道,品質(zhì)好的意大利干腌火腿蛋白質(zhì)水解指數(shù)在22%～30%之間,蛋白質(zhì)水解指數(shù)小于20%時(shí)火腿缺乏應(yīng)有的風(fēng)味,而大于30%時(shí)火腿質(zhì)地變軟,有明顯的金屬味和苦味[19]。成品腿蛋白質(zhì)水解指數(shù)為25.3%,比較適中,表明宣恩火腿生產(chǎn)過程中對(duì)蛋白質(zhì)的水解程度控制較好。

表1 宣恩火腿不同階段非蛋白氮含量及水解指數(shù)變化(干基,mg/100 g)Table 1 Changes of non-protein nitrogen content and hydrolysis index in different stages of Xuanen ham(DW,mg/100 g)

綜合分析,宣恩火腿非蛋白氮含量隨著加工的進(jìn)行持續(xù)上升,表明蛋白質(zhì)的水解伴隨整個(gè)加工過程,在發(fā)酵期尤其是發(fā)酵末期這種水解反應(yīng)更為劇烈。

2.1.2 非蛋白氮組成變化 從表2可以看出,宣恩火腿在腌制期前多肽氮含量無顯著性變化(P>0.05),腌制期結(jié)束后多肽氮含量呈快速上升,尤其是在發(fā)酵中期以后,多肽氮含量快速升高,發(fā)酵中期多肽氮含量是發(fā)酵初期的1.6倍,成品中多肽氮含量是發(fā)酵中期的1.8倍。宣恩火腿生產(chǎn)過程中經(jīng)過鹽腌后肌內(nèi)食鹽含量迅速上升,此時(shí)內(nèi)源酶中的肽酶活性受到抑制,因而前期多肽氮含量變化不明顯,但隨著發(fā)酵的深入,內(nèi)源酶逐漸適應(yīng)了這種高鹽環(huán)境,酶活逐漸復(fù)蘇,蛋白質(zhì)逐漸開始水解,更為重要的是在發(fā)酵中期火腿表面滋生大量微生物,這些微生物分泌的包括肽酶在內(nèi)的外源酶開始起作用,使得蛋白質(zhì)的水解加速。在此過程中,更高分子量的肌原纖維蛋白降解產(chǎn)生的肽是多肽氮含量上升的主要原因[20]。

表2 宣恩火腿不同階段各非蛋白氮含量變化(干基,mg/100 g)Table 2 Changes of each non-protein nitrogen content in different stages of Xuanen ham(DW,mg/100 g)

宣恩火腿中氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵中期之前其含量不斷升高,隨后略有下降,這也正好與火腿風(fēng)味物質(zhì)主要在發(fā)酵后期產(chǎn)生相一致。蛋白質(zhì)和肽在組織蛋白酶的作用下降解成游離氨基酸,導(dǎo)致火腿中氨基酸態(tài)氮含量的升高,但氨基酸又會(huì)通過斯托克斯降解和麥拉德反應(yīng)等進(jìn)一步生成一些揮發(fā)性的風(fēng)味化合物,其含量又會(huì)緩慢下降[21]。

揮發(fā)性鹽基氮可用于反映諸如火腿等腌臘肉制品中蛋白質(zhì)的變化,來探索火腿風(fēng)味、安全性等。研究表明,當(dāng)火腿中揮發(fā)性鹽基氮含量在25～71 mg/100 g時(shí),火腿中能產(chǎn)生特有的香氣[22]。原料腿中揮發(fā)性鹽基氮含量較低,僅為7.71 mg/100 g,腌制期上升至16.6 mg/100 g。進(jìn)入發(fā)酵階段后揮發(fā)性鹽基氮含量迅速上升至峰值,達(dá)到73.4 mg/100 g,隨后下降。揮發(fā)性鹽基氮的變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,蛋白質(zhì)不斷分解產(chǎn)成但同時(shí)又不斷揮發(fā)散失,前期火腿水分含量較高,適合腐敗微生物的生長(zhǎng),揮發(fā)性鹽基氮含量迅速增加,發(fā)酵后期,隨著火腿中的含水量逐漸減少,腐敗微生物的作用受到抑制,揮發(fā)性鹽基氮生成速度減緩,所以到了后期火腿中揮發(fā)性鹽基氮含量呈緩慢下降趨勢(shì)。

綜合分析,多肽氮在整個(gè)加工周期內(nèi)持續(xù)上升,發(fā)酵末期上升幅度更大,這與肌原纖維蛋白水解有關(guān)。氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵中前期由于蛋白質(zhì)和肽的水解而快速升高,末期略有下降,主要原因是部分氨基酸進(jìn)一步反應(yīng)損失了。揮發(fā)性鹽基氮含量變化規(guī)律跟氨基酸態(tài)氮一致,主要原因是發(fā)酵初期腐敗菌滋生導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解成胺等,隨后火腿水分含量逐漸減少其活性受到抑制,揮發(fā)性鹽基氮含量逐步下降。

蛋白質(zhì)降解形成的這些非蛋白氮對(duì)肌肉pH產(chǎn)生一定影響,不同階段宣恩火腿肌肉pH測(cè)定結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出,宣恩火腿在加工過程中pH整體呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05),主要原因是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生了氨、胺以及堿性氨基酸等堿性物質(zhì)所致,這與金華火腿[23]中pH變化規(guī)律一致,pH的變化也從側(cè)面反映了蛋白質(zhì)的降解。

表3 宣恩火腿不同階段肌肉pH變化Table 3 Changes of pH in different stages of Xuanen ham

2.1.3 游離氨基酸組成變化 從表4可以看出,宣恩火腿游離氨基酸總量隨著加工的不斷深入逐漸升高,從原料腿中的976.9 mg/100 g增加到成品的4853.7 mg/100 g,增長(zhǎng)了4.9倍,游離氨基酸含量在發(fā)酵期漲幅更快,表明此階段是蛋白質(zhì)降解的高峰期。呈味氨基酸含量也是隨著加工的進(jìn)行逐漸升高,從原料腿到成品增長(zhǎng)了5.9倍,尤其是谷氨酸含量增長(zhǎng)了29.6倍,由于成品火腿肌肉pH為6.75,正好能夠使谷氨酸以谷氨酸鈉形式存在,使得火腿能夠呈現(xiàn)較強(qiáng)的鮮味。在發(fā)酵前期氨基酸含量快速上升,到了發(fā)酵末期氨基酸含量上升幅度已經(jīng)變緩,主要原因是纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸等氨基酸含量出現(xiàn)了下降,形成這種下降的主要原因是這些氨基酸經(jīng)斯托克斯降解反應(yīng)生成了吡嗪、醛、酮、醇、含硫化合物等揮發(fā)性風(fēng)味成分,這些物質(zhì)是火腿特有風(fēng)味的重要來源之一[24]。

表4 宣恩火腿不同階段游離氨基酸組成變化(干基,mg/100 g)Table 4 Changes of free amino acid composition in different stages of Xuanen ham(DW,mg/100 g)

綜合分析,火腿游離氨基酸含量在發(fā)酵期上升較快,表明蛋白質(zhì)的降解階段主要發(fā)生在發(fā)酵期。鮮味氨基酸在發(fā)酵末期快速上升,一方面是谷氨酸等呈味氨基酸含量大幅增加,二是部分氨基酸降解形成新的風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 宣恩火腿加工過程中蛋白氮變化

2.2.1 蛋白質(zhì)組成變化分析 對(duì)宣恩火腿各蛋白分級(jí)并測(cè)定了其含量,從表5可以看出,肌原纖維蛋白和肌漿蛋白在整個(gè)加工階段都呈下降趨勢(shì),且肌漿蛋白下降幅度更大,表明這兩類蛋白質(zhì)的降解伴隨著整個(gè)火腿的加工周期。而肉基質(zhì)蛋白含量在發(fā)酵初期結(jié)束時(shí)有一個(gè)較大幅度上升,隨后基本穩(wěn)定。火腿中肌原纖維蛋白和肌漿蛋白含量的減少主要有兩方面的原因:一是由于熱作用導(dǎo)致這兩部分蛋白變性,改變了其溶解性而轉(zhuǎn)變成基質(zhì)蛋白,基質(zhì)蛋白在發(fā)酵初期顯著升高可以證實(shí)這一點(diǎn)。因?yàn)殡缰平Y(jié)束后是烘腿工序,在此期間肌原纖維蛋白和肌漿蛋白熱變性轉(zhuǎn)為不溶的肉基質(zhì)蛋白。二是肌原纖維蛋白和肌漿蛋白發(fā)生了降解,形成了多肽和氨基酸等,這一點(diǎn)從非蛋白氮含量的逐步升高可以得到證實(shí)。各蛋白質(zhì)的含量變化也與后續(xù)蛋白質(zhì)電泳結(jié)果基本吻合。本研究結(jié)果與汪玉霞[11]研究的金華火腿、孫為正[25]研究的廣式臘腸中蛋白質(zhì)降解規(guī)律基本一致。

表5 宣恩火腿不同階段各蛋白質(zhì)含量變化(干基,g/100 g)Table 5 Changes of each protein in different stages of Xuanen ham(DW,mg/100 g)

綜合分析,宣恩火腿中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均由于降解而含量下降,特別是在發(fā)酵期內(nèi)降幅更大,肌漿蛋白降解比肌原纖維蛋白更徹底。肉基質(zhì)蛋白含量在發(fā)酵初期由于蛋白質(zhì)的熱變性而升高,隨后保持穩(wěn)定。

2.2.2 蛋白質(zhì)電泳分析 由圖2A可知，肌漿蛋白從發(fā)酵初期便開始發(fā)生降解,尤其是一些低分子量的組分降解更為明顯。分子量在14.4～20.1 kDa之間的蛋白片段發(fā)生降解,可能是肌紅蛋白隨著血水的滲出而損失或肌紅蛋白發(fā)生降解[11]。肌漿蛋白包括很多酶類,火腿在加工過程中受到了一些鹽、熱、酸的影響,導(dǎo)致其變性,一些蛋白質(zhì)條帶逐漸變淺,例如29、67、90 kDa等條帶。同時(shí)也有一些條帶加深,比如43 kDa的蛋白質(zhì)條帶,可能是更高分子量的肌原纖維蛋白降解的結(jié)果。從電泳圖中可以看出肌漿蛋白主要在發(fā)酵初期大量降解,加工后期變化不大。

由圖2B可知,肌原纖維蛋白在發(fā)酵中期開始明顯降解。肌原纖維蛋白由肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白和肌球蛋白等組成,對(duì)肉制品的凝膠特性有重要影響[26]。由圖2B可以看出,在發(fā)酵中期逐漸生成了一些蛋白質(zhì)條帶例如45～94 kDa之間的蛋白質(zhì)片段,輕酶解肌球蛋白(17 kDa)在加工過程中逐步降解,到了發(fā)酵末期幾乎完全消失。

圖2 宣恩火腿各組分蛋白質(zhì)電泳圖Fig.2 Electropherogram of various protein of Xuanen ham注:M-Marker,1-原料腿,2-腌制期,3-發(fā)酵初期,4-發(fā)酵中期,5-成品。

由圖2C可知,堿溶蛋白條帶在發(fā)酵初期開始逐漸變深,這與其含量在這一加工階段開始升高是一致的。從堿溶蛋白條帶與肌漿蛋白和肌原纖維蛋白條帶對(duì)比分析可以看出,堿溶蛋白含量的升高主要是肌漿蛋白和肌原纖維蛋白轉(zhuǎn)化而來。

由圖2D可知,堿不溶蛋白的條帶變化不明顯,這是因?yàn)閴A不溶蛋白主要包括膠原蛋白、粘性蛋白和網(wǎng)狀蛋白等大分子蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)性質(zhì)比較穩(wěn)定,在宣恩火腿加工過程中基本不會(huì)發(fā)生太大變化。

綜合分析,肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和堿溶蛋白在整個(gè)加工周期內(nèi)都發(fā)生了變化,而堿不溶蛋白基本保持穩(wěn)定。肌漿蛋白在發(fā)酵初期就已經(jīng)開始降解,小分子片段基本消失;肌原纖維蛋白在發(fā)酵中期開始大量降解,降解形成了一些大分子片段,可能是一些多肽;堿溶蛋白在發(fā)酵其內(nèi)濃度迅速上升,結(jié)構(gòu)并無太大變化;堿不溶蛋白保持穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文主要研究了宣恩火腿在加工過程中五個(gè)階段蛋白質(zhì)的變化情況,研究結(jié)果表明:宣恩火腿中非蛋白氮含量隨著加工的進(jìn)行持續(xù)上升,從原料腿中的685.9 mg/100 g增加到成品的1724.3 mg/100 g,非蛋白氮的增加主要來源于蛋白質(zhì)的水解,在發(fā)酵期尤其是發(fā)酵末期這種水解反應(yīng)表現(xiàn)得更為劇烈。非蛋白氮中的多肽氮在整個(gè)加工周期內(nèi)持續(xù)上升,發(fā)酵末期上升幅度更大,氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵中前期快速升高,末期略有下降,揮發(fā)性鹽基氮含量變化規(guī)律跟氨基酸態(tài)氮一致。呈味氨基酸含量在整個(gè)加工過程中上升明顯,從315.8 mg/100 g增加到2171.3 mg/100 g,其中鮮味較強(qiáng)的谷氨酸含量增加了29.6倍。呈味氨基酸在發(fā)酵期呈快速上升趨勢(shì),表明此階段是火腿風(fēng)味形成關(guān)鍵期。宣恩火腿各蛋白質(zhì)中,肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均由于降解而含量下降,特別是在發(fā)酵中后期降幅更大,肌漿蛋白比肌原纖維蛋白降解更徹底。肉基質(zhì)蛋白含量在發(fā)酵初期由于蛋白質(zhì)的熱變性而升高,隨后保持穩(wěn)定。總而言之,蛋白質(zhì)的水解伴隨著整個(gè)宣恩火腿的加工過程,尤其是在發(fā)酵中后期,這種水解程度更為明顯,為火腿特有風(fēng)味的形成產(chǎn)生重要作用。