張 瑩，程曉東，胡玉皎，王 昊，周鐵成，郝曉柯

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)中心，西安 710032)

糖皮質(zhì)激素可用于治療多種自身免疫性疾病，但糖皮質(zhì)激素沖擊治療或長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致的股骨頭壞死會(huì)給患者帶來更大的痛苦，怎樣合理有效的使用激素沖擊治療顯得尤為重要。隨著基因概念的提出和化學(xué)藥物用藥的深入研究，大量的研究表明由于基因存在的多態(tài)性導(dǎo)致同一藥物對(duì)不同人群及個(gè)體所產(chǎn)生的效果和反應(yīng)不同，而導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。甲強(qiáng)龍的耐藥位點(diǎn)PAI-1(4G/5G) 是纖溶酶原激活物抑制劑的效應(yīng)分子，PAI-1(4G/5G)的突變與心腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)[1-2]，與深靜脈血栓的形成有關(guān)[3]，也有文獻(xiàn)報(bào)道，PAI-1(4G/5G)的突變可導(dǎo)致股骨頭壞死的發(fā)生[4-5]。甲強(qiáng)龍的耐藥位點(diǎn)ABCB1(3435T>C) 是糖皮質(zhì)激素的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，ABCB1(3435T>C)的突變會(huì)導(dǎo)致藥物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝障礙[6]。使用激素甲強(qiáng)龍治療的患者，這兩個(gè)耐藥位點(diǎn)基因的突變將會(huì)給患者帶來嚴(yán)重的后果，有必要在用藥前給患者做相應(yīng)的化學(xué)藥物耐藥位點(diǎn)檢測(cè)。

本文使用數(shù)字熒光檢測(cè)儀和熒光染色原位雜交技術(shù)，實(shí)現(xiàn)小片段測(cè)序和SNP分型，檢測(cè)甲強(qiáng)龍耐藥位點(diǎn)PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C)，根據(jù)不同患者的基因型特性進(jìn)行合理用藥，達(dá)到提高藥效、降低毒性和減少不良反應(yīng)發(fā)生的效果，為甲強(qiáng)龍藥物使用的患者提供精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 我院2016年8月～2018年1月接受甲強(qiáng)龍耐藥位點(diǎn)PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C)檢測(cè)的患者94例(其中天皰瘡類疾病患者39例，皮肌炎類患者30例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者25例)，男性37例，女性57例，平均年齡43.69±11.49歲。

1.2 試劑和儀器 試劑：10×NH4Cl預(yù)處理液，處理血液樣本時(shí)用于裂解紅細(xì)胞；耀金保(核酸純化試劑)，用于在進(jìn)行SNP分析前保存標(biāo)本；耀金分(測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒)，用于數(shù)字熒光分子雜交、化學(xué)藥物用藥指導(dǎo)時(shí)的樣本分析；軟件設(shè)定液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；陽性對(duì)照監(jiān)測(cè)儀器是否在控。以上試劑均由北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司提供。儀器：TL998A熒光檢測(cè)儀(西安天隆科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本：2～3 ml靜脈全血(不需空腹)，使用一次性真空采血管(EDTA抗凝紫帽管)采集，于4℃低溫保存，保存時(shí)間不宜超過24 h。

1.3.2 標(biāo)本前處理：在1.5 ml離心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl預(yù)處理液，吸取200 μl混勻的全血，室溫靜置5 min，待紅細(xì)胞完全破裂，液體顏色變?yōu)槌吻宓募t色后3 000 r/min離心5 min。將上層透明紅色液體吸取干凈，向管底富集的白細(xì)胞團(tuán)塊中加入30 μl耀金保使白細(xì)胞的胞膜破裂。充分混勻，為了更好的使細(xì)胞核內(nèi)的核酸游離出來，室溫靜置30～60 min，等待檢測(cè)。

1.3.3 檢測(cè)過程：樣本檢測(cè)：吸取1.5 μl處理后的白細(xì)胞樣本加到相應(yīng)的試劑中上機(jī)檢測(cè)。陽性對(duì)照：吸取1.5 μl的陽性質(zhì)控品分別加到對(duì)應(yīng)的軟件設(shè)定液中。陰性對(duì)照：吸取1.5 μl耀金保保存液，加到試劑中。

1.3.4 質(zhì)控結(jié)果分析：陰性對(duì)照用以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室和前處理過程中是否存在污染，檢出結(jié)果應(yīng)為“重測(cè)”；陽性對(duì)照用以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，檢出結(jié)果應(yīng)為陽性質(zhì)控品的基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 收集、記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，錄入SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和相關(guān)處理，定性資料以百分率(%)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 甲強(qiáng)龍化學(xué)藥物基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果 PAI-1(4G/5G)位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為5G5G的患者20人，占總?cè)藬?shù)的21.28%；檢測(cè)結(jié)果為4G5G的患者43人，占總?cè)藬?shù)的45.74%；檢測(cè)結(jié)果為4G4G的患者31人，占總?cè)藬?shù)的32.98%。ABCB1(3435T>C) 位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為TT的患者17人，占總?cè)藬?shù)的18.09%；檢測(cè)結(jié)果為TC的患者44人，占總?cè)藬?shù)的46.81%；檢測(cè)結(jié)果為CC的患者33人，占總?cè)藬?shù)的35.10%。激素甲強(qiáng)龍化學(xué)藥物兩個(gè)耐藥位點(diǎn)間檢測(cè)結(jié)果對(duì)于評(píng)估股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.855，P=0.142)。

2.2 激素甲強(qiáng)龍化學(xué)藥物各個(gè)基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)度分布情況 對(duì)于PAI-1(4G/5G)基因，激素甲強(qiáng)龍沖擊治療引起股骨頭壞死高風(fēng)險(xiǎn)的基因型是4G5G/4G4G，占78.72%(74/94)，5G5G基因型為低風(fēng)險(xiǎn)基因占21.28%(20/94)；對(duì)于ABCB1(3435T>C)基因，CC基因型為高風(fēng)險(xiǎn)基因，占35.10%(33/94)，TT/TC基因型為低風(fēng)險(xiǎn)基因，占64.90%(61/94)。

PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因均為高風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為高風(fēng)險(xiǎn)；PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因有一個(gè)為高風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為中等風(fēng)險(xiǎn)；PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因均為低風(fēng)險(xiǎn)基因型時(shí)，患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為低風(fēng)險(xiǎn)。

故激素甲強(qiáng)龍的用藥情況，12.77%(12/94)的患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為低風(fēng)險(xiǎn)；60.63%(57/94)的患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為中等風(fēng)險(xiǎn)，在進(jìn)行治療時(shí)需要關(guān)注骨骼反應(yīng)；但是還有26.60%(25/94)的患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)是高風(fēng)險(xiǎn)，需高度關(guān)注骨骼反應(yīng)，同時(shí)配伍用雙膦酸鹽，降低激素劑量并換用其他藥物，也可使用阿司匹林等藥物進(jìn)行治療降低風(fēng)險(xiǎn)。

3討論糖皮質(zhì)激素沖擊治療可用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、全身性皮肌炎(多發(fā)性肌炎)、天皰瘡、嚴(yán)重的多形紅(Stevens-Johnson綜合征)、剝脫性皮炎、大皰疹性皮炎、嚴(yán)重的脂溢性皮炎、嚴(yán)重的銀屑病、蕈樣真菌病、蕁麻疹等皮膚病。但是激素沖擊治療或長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致的股骨頭壞死會(huì)給患者帶來更大的痛苦，合理有效的使用激素治療顯得尤為重要。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，化學(xué)藥物用藥的深入研究，發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性的存在，導(dǎo)致同一藥物對(duì)不同人群及個(gè)體所產(chǎn)生的效果和反應(yīng)不同，導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

甲強(qiáng)龍的耐藥基因PAI-1(4G/5G) 是纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor，PAI)-1的效應(yīng)分子，PAI-1是血漿纖溶系統(tǒng)中主要的一種抑制物，可以控制和降低纖溶系統(tǒng)的活性，通過PAI-1的調(diào)節(jié)作用，維持纖溶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，才能保持血漿纖溶活性。因此，血液循環(huán)中PAI-1水平異常，就容易誘發(fā)血栓形成[7-8]。股骨頭本身血液供應(yīng)有限，如并發(fā)血栓風(fēng)險(xiǎn)則會(huì)大大提升壞死風(fēng)險(xiǎn)。PAI-1(4G/5G) 基因突變，血漿纖溶活性降低，血栓形成，股骨頭血液供應(yīng)減少，股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)提高[9-10]。

甲強(qiáng)龍的另一個(gè)耐藥基因ABCB1(3435T>C) 是多耐藥基因1的3435位點(diǎn)，是糖皮質(zhì)激素藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體。ABCB1位于第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，含29個(gè)外顯子，位于26號(hào)外顯子C3435T位置的許多個(gè)單核苷酸多態(tài)性SNP位點(diǎn)最被廣泛研究。內(nèi)源性及外源性的糖皮質(zhì)激素均是P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，CROWE等[11]研究顯示，在Caco-2細(xì)胞株中，激素向細(xì)胞內(nèi)的滲透受P-gp的限制，ABCB1基因的敲除或表達(dá)降低，均使組織或細(xì)胞內(nèi)激素的濃度降低。GONG等[12-13]對(duì)ABCB1(3435T>C)基因多態(tài)性與糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死的研究進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示C等位基因增加了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭壞死的相關(guān)性，我國(guó)學(xué)者也做了類似的研究。

本文研究結(jié)果顯示，根據(jù)激素甲強(qiáng)龍PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C) 2個(gè)耐藥位點(diǎn)對(duì)患者進(jìn)行糖皮質(zhì)激素沖擊治療時(shí)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估是一致的。根據(jù)2個(gè)耐藥位點(diǎn)對(duì)風(fēng)限度的評(píng)估，12.77%的患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為低風(fēng)險(xiǎn)，60.63%的患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為中度風(fēng)險(xiǎn)，在進(jìn)行治療時(shí)需要關(guān)注骨骼反應(yīng)，一旦有不良反應(yīng)征象，即配伍用雙膦酸鹽，而26.60%的患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)引起股骨頭壞死的風(fēng)險(xiǎn)為高風(fēng)險(xiǎn)，這些患者進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療時(shí)需高度關(guān)注骨骼反應(yīng)，同時(shí)配伍用雙膦酸鹽，降低激素劑量并換用其他藥物，也可使用阿司匹林等藥物進(jìn)行治療降低風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在進(jìn)行激素甲強(qiáng)龍沖擊治療前給患者作甲強(qiáng)龍化學(xué)藥物基因檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果合理精準(zhǔn)用藥，可以使26.60%的患者避免股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)的出現(xiàn)，為患者提供安全的用藥指導(dǎo)。