海霞霞，朱娜，王俊燕，肖晶晶，畢逢辰，鄭曉敏，李云鴻，王銀

（寧夏顱腦疾病重點實驗室，寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocyte，OL）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘形成細(xì)胞，其發(fā)育異常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的形成有關(guān)[1]。研究[2，3]發(fā)現(xiàn)多種因子可以促進或抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化，包括轉(zhuǎn)錄因子和神經(jīng)元旁分泌因子等。內(nèi)向整流鉀離子通道Kir4.1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著很多重要的作用，但是其在少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）的發(fā)育過程中是否發(fā)揮作用還是未知。有研究[4]表明，多發(fā)硬化癥的病人在炎癥狀態(tài)下，Kir4.1通道的蛋白表達大量增加，產(chǎn)生Kir4.1通道的自身抗體。這提示在髓鞘相關(guān)疾病當(dāng)中，Kir4.1通道可能參與其中并發(fā)揮某種作用。本文擬研究Kir4.1通道對OPC增殖和分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibico公司；蛋白定量BCA試劑盒和Mouse抗HRP標(biāo)記二抗購自Pierce公司；desipramine購自Tocris公司；MBP抗體購自Millipore公司；PCR引物由生工公司合成；GAPDH抗體購自Cell Signaling公司；Ki67抗體購自Abcam公司。

1.2 方法 （1）大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞原代培養(yǎng)：剪下出生后3 d SD大鼠的頭部，取出大腦，顯微鏡下去除其海馬和血管膜留下大腦皮層；37oC胰酶消化20 min，打散細(xì)胞，培養(yǎng)在多聚賴氨酸鋪的培養(yǎng)瓶；每3天換一次培養(yǎng)液；第7 d時，分別以200 r/min和1，100 r/min的轉(zhuǎn)速37oC搖細(xì)胞1 h和16 h去除小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞；將上清離心，沉淀便是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，培養(yǎng)在多聚賴氨酸培養(yǎng)皿中。（2）利用Western blot檢測Kir4.1和MBP表達：抑制劑Des處理前后，提取各組細(xì)胞的蛋白并收集上清液，BCA法進行蛋白定量。利用10% SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用脫脂牛奶在搖床上封閉膜2 h。加入一抗，4oC過夜。利用TBST充分洗滌膜后，用二抗室溫孵育1 h，ECL試劑顯色成像。（3）利用PCR檢測Kir4.1和MBP mRNA水平：提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用PCR試劑盒，依據(jù)操作步驟，進行PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.9進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較用方差分析，進一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

2 結(jié)果

2.1 Kir4.1和MBP在OL細(xì)胞中表達升高 PCR和Western blot結(jié)果表明，OPC中和OL中都有Kir4.1基因和蛋白表達，但在OL中表達更高。MBP只在OL中表達，因為MBP是成熟的OL的標(biāo)志。

2.2 阻斷Kir4.1可以抑制OPC向OL細(xì)胞分化 Western blot結(jié)果顯示，利用desipramine阻斷Kir4.1后，MBP的表達顯著減少，說明阻斷Kir4.1抑制了OPC向OL細(xì)胞分化。

2.3 阻斷Kir4.1可以促進OPC的增殖 抑制劑處理后，對細(xì)胞增殖因子ki67的檢測結(jié)果顯示，其表達增加，顯示阻斷Kir4.1促進了OPC的增殖。

3 討論

少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常會導(dǎo)致髓鞘形成障礙，形成多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘相關(guān)疾病，比如多發(fā)硬化癥、視神經(jīng)炎等，給社會和患者家庭都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[5]。本課題的研究意義在于對中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘相關(guān)疾病的機制進行探索，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘相關(guān)疾病提供一些理論基礎(chǔ)。OPC向OL的正常分化是CNS髓鞘正常形成的必要條件。但是目前雖然對OPC分化機制的研究已經(jīng)取得了一些進展，但其具體機制尚不十分清楚。

有研究[6]報道，在多發(fā)硬化癥病人的OL上內(nèi)向整流鉀通道Kir4.1的免疫活性降低，但是Kir4.1對OPC發(fā)育的影響還不清楚。因此我們研究了Kir4.1對OPC發(fā)育的影響。

我們的實驗結(jié)果顯示Kir4.1在OPC和OPC中都有表達，但是OL中更高。阻斷Kir4.1，促進了OPC的增殖，但是抑制了OPC的分化，其機制還有待于進一步研究。但是Kir4.1或許可作為髓鞘相關(guān)疾病的一個新靶點。