海洋酸度變化下孔石莼對(duì)農(nóng)藥硫丹的生態(tài)響應(yīng)研究?

李曉東， 譚海麗， 尤 宏,2??

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264200；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程系，城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150090)

海洋酸化是指由于海洋吸收、釋放大氣中過量的二氧化碳，導(dǎo)致海水逐漸變酸的過程。聯(lián)合國政府間氣候變化委員會(huì)(IPCC)第五次評(píng)估報(bào)告指出：自工業(yè)革命以來，海水pH 值已下降了0.1 個(gè)單位，相當(dāng)于氫離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了26%[1]，海洋酸化成為繼“溫室效應(yīng)”之后又一由CO2過量排放而引起的全球性環(huán)境問題。

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，環(huán)境中農(nóng)藥殘留問題日漸引起廣泛關(guān)注。其中硫丹是一種廣譜有機(jī)氯殺蟲劑，1954年由德國Hoechst 公司研制開發(fā)，因具備良好的胃毒和觸殺作用，曾被廣泛的運(yùn)用在農(nóng)業(yè)谷物、蔬菜、水果、棉花、林木等病蟲害防治[2]，2011年4月29日硫丹被列入斯德哥爾摩公約禁用物質(zhì)列表，目前世界上已有60多個(gè)國家禁止使用，但由于過去幾十年硫丹的大量使用加上其潛在的遷移能力，全球范圍內(nèi)各種環(huán)境介質(zhì)中，如大氣、土壤、沉積物、水體均已普遍檢測出硫丹，中國從2003年在部分水體中就檢出硫丹[3-6]。

同時(shí)硫丹對(duì)水生生物有極高的毒性，并且隨著海洋酸化的加劇，海水pH值的降低會(huì)導(dǎo)致海水中硫丹溶解度的增加，降解速度的減緩，對(duì)海洋生物的生態(tài)毒性效應(yīng)將會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)。2017年2月2日，我國環(huán)境保護(hù)部環(huán)境保護(hù)對(duì)外合作中心與聯(lián)合國開發(fā)計(jì)劃署(UNDP)共同開發(fā)的 “中國硫丹淘汰項(xiàng)目”獲得全球環(huán)境基金(GEF)批準(zhǔn)。表明硫丹對(duì)生物的毒害性已引起國際社會(huì)和政府的廣泛關(guān)注。

目前國內(nèi)外對(duì)硫丹的研究，主要集中在對(duì)動(dòng)物的毒性效應(yīng)，如在高等哺乳動(dòng)物和部分魚類[7-9]，而對(duì)于水生浮游植物的毒性研究較少；硫丹有著較強(qiáng)的生態(tài)毒性，并且隨著海洋酸化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，硫丹的理化性質(zhì)也受到了影響，如硫丹的溶解度隨海水 pH 值的降低而增大，并且在低 pH 環(huán)境下硫丹在水中的半衰期增大，降解速率變緩。大型海藻是海洋中初級(jí)生產(chǎn)力的重要組成部分，在不到海洋總面積1%的沿岸帶構(gòu)成海洋總初級(jí)生產(chǎn)力的10%，在近岸碳循環(huán)方面起著至關(guān)重要的作用，還可為海洋中的無脊椎動(dòng)物及魚類提供產(chǎn)卵孵化和棲息的場所，而人類活動(dòng)導(dǎo)致的環(huán)境變化問題正逐漸加劇，因此研究硫丹和海水酸度變化耦合作用對(duì)大型海藻的影響有著深遠(yuǎn)的意義。本文以綠藻門的孔石莼(UlvapertusaKjellman)為研究對(duì)象，考察了硫丹單獨(dú)脅迫及其與酸度聯(lián)合脅迫下對(duì)孔石莼在個(gè)體及生理生化方面的影響，為今后減輕硫丹對(duì)大型海藻及海洋生態(tài)系統(tǒng)的危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)中的大型海藻孔石莼均采自威海市三連島潮間帶海域(海水pH=8.1 ，溫度16 ℃，鹽度31)。采集時(shí)選擇健康一致的藻體，放在盛有少量海水的塑料袋中于2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，選擇生長良好的藻體，洗凈附著的泥沙和浮游生物，其中將孔石莼打成直徑1.5 cm的圓片，在實(shí)驗(yàn)室溫度(20 ℃)及光照條件(光照周期為L∶D = 12 h∶12 h)下放入5 L玻璃缸中馴養(yǎng)采用滅菌后的陳海水(pH=8.2鹽度31)，每天24 h曝氣。馴養(yǎng)4 d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

硫丹 EC 乳油，有效含量為 35%，購自于河北省冀州市凱明農(nóng)藥有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成有效含量為 10 mg·L-1的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)按所需質(zhì)量濃度進(jìn)行稀釋。其余試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

電子天平(臺(tái)衡MP200A，中國)、實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(METTLER TOLEDOFE20，瑞士)、立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(致微GI54T，中國)、潔凈工作臺(tái)(安泰SW-CJ，中國)、紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯TU-1800S，中國)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(利康Neofuge BR，中國香港)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)海水實(shí)際酸度，設(shè)定2個(gè)pH梯度，分別為7.9和8.2；根據(jù)硫丹預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置濃度梯度為0、50、150、250、350 μg/L的硫丹實(shí)驗(yàn)組及pH聯(lián)合脅迫實(shí)驗(yàn)設(shè)置如表1所示，每個(gè)處理組中設(shè)置3個(gè)平行樣，在超凈工作臺(tái)內(nèi)每組接種孔石莼1.3 g左右，實(shí)驗(yàn)周期為7 d，每天用0.01 mol/L NaOH和0.01 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)各處理組培養(yǎng)液的pH。

表1 硫丹及pH聯(lián)合脅迫實(shí)驗(yàn)各處理組的設(shè)計(jì)Table 1 Design of endosulfan and pH stress experiment treatment groups

Note:①Groups；②Endosulfan concentration

1.4 孔石莼生長情況的測定

各實(shí)驗(yàn)組分別于暴露第1天、第3天及第7天測定孔石莼藻體鮮重的變化，孔石莼葉片稱量前用吸水紙吸干。根據(jù)公式(1)計(jì)算孔石莼的相對(duì)生長率：

相對(duì)生長率(%) = [ ln(Wt/W0) /t]×100%。

(1)

其中：W0為初始濕重；Wt為td后的濕重。

1.5 葉綠素含量的測定

各實(shí)驗(yàn)組，分別于暴露第1、3、7天取出藻體0.2 g，放入預(yù)冷的研缽，加入少量石英砂和碳酸鎂粉后在冰浴上研磨，之后加入10 mL 95%乙醇，在4 ℃冰箱中避光提取24 h，提取完畢在4 000 r/min 下離心 20 min，測定上清液在665、649和470 nm波長下的吸光度，并計(jì)算光合色素的含量。葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素濃度計(jì)算公式如下：

Ca=13.95A665-6.88A649；

(2)

Cb=24.96×A649-7.32×A665；

(3)

Cx·c=4.08A470+3.31A665-11.64A649。

(4)

其中：Ca為葉綠素a的濃度；Cb為葉綠素b的濃度；Cx·c為類胡蘿卜素的濃度；A665、A649和A470為665、649和470 nm的吸光度值。

1.6 抗氧化酶活力的測定

每個(gè)處理組分別于暴露第1天、第3天及第7天另取孔石莼葉片0.2 g，于預(yù)冷的研缽中加1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH=7.8)在冰浴上研磨成漿，加磷酸緩沖液使體積為5 mL，于4 000 r/min下離心20 min后，取上清液測定蛋白質(zhì)含量及酶活力。

SOD活性的測定采用Bewley等[10]改進(jìn)的氮藍(lán)四唑(NBT)光化學(xué)反應(yīng)法，POD活性的測定采用 Srivestava[11]等改進(jìn)的愈創(chuàng)木酚法。可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行[12]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD) 表示，采用 SPSS 19.0軟件對(duì)硫丹單獨(dú)脅迫后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)硫丹脅迫后與pH耦合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多因素方差分析，分析硫丹、pH及硫丹于pH耦合后對(duì)孔石莼個(gè)體及生理生化方面的影響。設(shè)置顯著水平為P<0.05，極其顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫丹脅迫及與pH耦合對(duì)孔石莼生長的影響

2.1.1 硫丹對(duì)孔石莼生長的影響 圖1為硫丹對(duì)孔石莼相對(duì)生長率的影響。由圖可知，隨著硫丹濃度的逐漸升高，孔石莼的相對(duì)生長率在第1天和第3天時(shí)均出現(xiàn)了顯著的先升高后下降的趨勢。對(duì)照組在第3天相對(duì)生長率升高了22.73%，而在第7天變化則不明顯。與對(duì)照組相比，各濃度處理組的相對(duì)生長率在第1天分別變化了98.45%、61.56%、-49.85%、-124.15%，在第3天分別變化了86.25%、27.99%、-92.99%、-169.59%，在第7天則分別變化了13.96%、-14.37%、-132.92%、-195%。由此可以看出，50 μg/L的處理組在第1天和第3天相對(duì)生長率得到明顯促進(jìn)，而在第7天基本上沒有促進(jìn)作用；250和350 μg/L處理組孔石莼的相對(duì)生長率均出現(xiàn)明顯的抑制作用(P<0.01)，并且抑制作用隨著暴露時(shí)間的延長而逐漸加劇。250 μg/L處理組孔石莼相對(duì)生長率從第1天至第3天下降了82.84%，第3天至第7天下降了551.33%，在第7天時(shí)出現(xiàn)了負(fù)增長現(xiàn)象，藻體葉片變薄并且表現(xiàn)出白化現(xiàn)象，而高濃度350 μg/L處理組的孔石莼在脅迫第1天就已出現(xiàn)了負(fù)增長，至第七天孔石莼葉片已表現(xiàn)出顏色變白、腐爛和非常易碎等癥狀。

圖1 硫丹對(duì)孔石莼相對(duì)生長率的影響Fig.1 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on relative growth rate (RGR) of Ulva pertusa

2.1.2 硫丹與pH耦合對(duì)孔石莼生長的影響 圖2為pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼相對(duì)生長率的影響，所有低pH的處理組與對(duì)照組相比都具有極顯著性(P<0.01)的差異。在環(huán)境pH和低pH條件下孔石莼受硫丹脅迫相對(duì)生長率都表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制效應(yīng)，并且均在50 μg/L處理組時(shí)相對(duì)生長率值達(dá)到最高峰。硫丹脅迫第1天，與對(duì)照組相比，環(huán)境pH和低pH的各濃度處理組分別變化了98.45%、61.56%、-49.85%、-124.15%和84.70%、222.43%、117.42%、-51.63%、-123.94% 。說明在硫丹暴露第1天時(shí)，孔石莼的相對(duì)生長率在低pH條件下受到的促進(jìn)作用更明顯，并且在L-0 μg/L處理組的相對(duì)生長率與對(duì)照組相比也表現(xiàn)為上升趨勢。在暴露第3天時(shí)，各處理組分別變化了86.25%、27.99%、-92.99%、-169.59%和81.60%、262.55%、106.95%、-92.55%、-177.07%。說明在低pH條件下暴露第3天時(shí)，孔石莼的相對(duì)生長率受到硫丹的脅迫作用更顯著，低濃度的刺激作用和高濃度的抑制作用更加明顯。至暴露第7天，各處理組分別變化了13.96%、-14.37%、-132.92%、-195%和69.61%、187.64%、43.42%、-140.37%、-201.95% 。隨著時(shí)間的延長，暴露第七天所有處理組孔石莼的相對(duì)生長率相對(duì)于第1天和第3天均有所下降。

pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼生長主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，暴露第1天、第3天及第7天硫丹、pH以及兩者的交互作用對(duì)孔石莼的生長都發(fā)揮了作用，并且具有極其顯著的影響(P<0.01)。

2.2 硫丹脅迫及與pH耦合對(duì)孔石莼光合色素的影響

2.2.1 硫丹對(duì)孔石莼光合色素的影響 圖3為硫丹對(duì)孔石莼葉綠素a含量的影響。在硫丹暴露第1天、第3天和第7天，低濃度50 μg/L處理組的葉綠素a含量都表現(xiàn)出一致的促進(jìn)作用，隨著硫丹濃度的增加，其他各濃度處理組呈現(xiàn)不同程度的抑制作用；隨著硫丹脅迫時(shí)間的延長，各濃度處理組的下降幅度不同，第1天至第3天，50和150 μg/L處理組葉綠素a的含量與對(duì)照組一樣無明顯變化趨勢。250和350 μg/L處理組在整個(gè)暴露期間表現(xiàn)出持續(xù)的下降趨勢，與對(duì)照組相比均表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)，說明高濃度硫丹對(duì)孔石莼葉綠素a有較大的損傷。在第3天，50 μg/L濃度處理組出現(xiàn)葉綠素a含量的最高峰值，至第7天后則出現(xiàn)了明顯下降，但與對(duì)照組相比，沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖2 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼相對(duì)生長率(RGR)的影響Fig.2 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on relative growth rate (RGR) of Ulva pertusa

圖3 硫丹對(duì)孔石莼葉綠素a含量的影響Fig. 3 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on Chlorophyll a content of Ulva pertusa

圖4為硫丹對(duì)孔石莼葉綠素b含量的影響。與第1天相比，各濃度組第3天葉綠素b的含量分別變化了2.8%、2.26%、1.15%、-4.73%、-15.68%，至第7天葉綠素b的含量分別變化了-13.29%、-13.95%、-6.88%、-17.66%、-30.46%。隨著硫丹濃度的增加和暴露時(shí)間的延長，葉綠素b受到的抑制作用越來越明顯，具有明顯的劑量-時(shí)間效應(yīng)。50 μg/L處理組的孔石莼在3個(gè)階段均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，表明一定濃度的硫丹農(nóng)藥會(huì)促進(jìn)孔石莼葉綠素b的合成和積累，之后葉綠素b含量開始回落，隨著硫丹濃度的增加而逐漸降低。

類胡蘿卜素不僅是藻類的主要捕光色素，也是生物體中的一種抗氧化劑，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，使生物細(xì)胞免受外界不良因子的傷害。由圖5可知，在硫丹脅迫后的第1天，與對(duì)照組相比，僅350 μg/L處理組的類胡蘿卜素含量表現(xiàn)出極顯著性差異(P<0.01)，其余處理組沒有顯著性差異(P>0.05)。然而隨著硫丹脅迫時(shí)間加長，各濃度處理組逐漸表現(xiàn)出明顯的差異性，至暴露第7天時(shí)，各硫丹處理組均出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)。說明硫丹脅迫下，孔石莼中類胡蘿卜素的響應(yīng)具有明顯的時(shí)間依賴效應(yīng)。

圖4 硫丹對(duì)孔石莼葉綠素b含量的影響Fig.4 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on Chlorophyll b content of Ulva pertusa

圖5 硫丹對(duì)孔石莼類胡蘿卜素含量的影響Fig.5 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on Carotenoids content of Ulva pertusa

2.2.2 硫丹與pH 耦合對(duì)孔石莼光合色素的影響 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼葉綠素a含量的影響如圖6所示，環(huán)境pH與低pH條件下，各處理組孔石莼葉綠素a含量都表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，并且低pH的各處理組與環(huán)境pH相比，孔石莼葉綠素a的含量相對(duì)下降。環(huán)境pH與低pH處理組均在暴露第3天50 μg/L處理組出現(xiàn)葉綠素a含量的峰值，并且與對(duì)照組相比，環(huán)境pH下的葉綠素a的含量升高了12.54%，然而低pH條件下的葉綠素a的含量是相對(duì)下降的。在低pH硫丹處理組，除了第7天的L-50 μg/L處理組之外，其余各處理組與對(duì)照組相比都顯現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.05)。L-0 μg/L處理組與對(duì)照組相比，葉綠素a的含量在第1天、第3天和第7天分別下降了21.66%、20.92%、52.69% 。表明在pH為7.9時(shí)孔石莼葉綠素a的含量是下降的。

圖6 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼葉綠素a的影響Fig.6 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on Chlorophyll a contentof Ulvapertusa

pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼葉綠素a主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，暴露第1天、第3天和第7天，硫丹、pH對(duì)孔石莼葉綠素a含量均具有顯著性影響(P<0.05)，而硫丹與pH的交互作用對(duì)孔石莼葉綠素a的影響較小，僅在脅迫后的第3天發(fā)揮顯著性效應(yīng)(P<0.05)，第1天和第7天均無顯著性差異(P>0.05)。

圖7為pH與不同濃度的硫丹耦合對(duì)孔石莼葉綠素b含量的影響。環(huán)境pH與低pH條件下，各處理組孔石莼葉綠素b含量都表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，均在50 μg/L硫丹濃度時(shí)上升，環(huán)境pH的50 μg/L濃度是在第3天出現(xiàn)葉綠素b含量的峰值，低pH的50 μg/L濃度是在第1天出現(xiàn)葉綠素b含量的峰值，并且低pH的各處理組與環(huán)境pH相比，孔石莼葉綠素b的含量相對(duì)下降。在低pH硫丹處理組，除暴露第1天L-0和L-50 μg/L處理組之外，其他各處理組與對(duì)照組相比都有顯著的差異性(P<0.05)。L-0 μg/L處理組與對(duì)照組相比，葉綠素b的含量在第1天、第3天和第7天分別下降了24.98%、21.20%、30.29% ，說明在pH為7.9的條件下孔石莼葉綠素b的含量是下降的。

pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼葉綠素b主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，暴露第1天、第3天和第7天，硫丹、pH對(duì)孔石莼葉綠素b含量都具有顯著性影響(P<0.05)。硫丹與pH的交互作用僅在脅迫后的第3天發(fā)揮顯著性效應(yīng)(P<0.05)，第1天和第7天均無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼葉綠素b的影響Fig.7 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on Chlorophyll b contentof Ulvapertusa

由圖8可知，環(huán)境pH以及低pH條件下，各處理組孔石莼類胡蘿卜素含量都表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，均在50 μg/L處理組上升，并且在第3天達(dá)到最大值。低pH的各處理組與環(huán)境pH相比，孔石莼類胡蘿卜素的含量相對(duì)下降。在低pH條件下，除了L-50 μg/L和暴露第1天的L-150 μg/L處理組之外，其他各處理組與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。L-0 μg/L處理組與對(duì)照組相比，類胡蘿卜素的含量在第1天、第3天和第7天分別下降了19.45%、11.62%、38.54% 。說明孔石莼體內(nèi)類胡蘿卜素的含量在pH為7.9時(shí)總體呈下降趨勢，但相對(duì)于第1天和第7天，第3天時(shí)類胡蘿卜素的含量有所上升。

圖8 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼類胡蘿卜素的影響Fig.8 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on Carotenoids content of Ulvapertusa

pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼類胡蘿卜素主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，硫丹、pH對(duì)孔石莼類胡蘿卜素含量都具有顯著性影響(P<0.05)，并且在第1天、第3天及第7天均發(fā)揮了顯著作用(P<0.05)。反而硫丹與pH的交互作用在第1天、第3天和第7天均沒有發(fā)揮顯著性效應(yīng)(P>0.05)。

2.3 硫丹脅迫及與pH耦合對(duì)孔石莼抗氧化酶活性的影響

2.3.1 硫丹對(duì)孔石莼抗氧化酶活性的影響 硫丹會(huì)誘導(dǎo)藻體細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成和清除平衡被破壞，從而造成氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)中主要考察了硫丹對(duì)孔石莼體內(nèi)兩種抗氧化酶，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的影響。硫丹對(duì)孔石莼SOD總活性的影響如圖9所示。硫丹暴露第1天，50 μg/L處理組的SOD總活性最高，與對(duì)照組相比變化了129.36%，之后隨著硫丹濃度的增加，各濃度處理組SOD總活性逐漸降低并且下降幅度基本上一致。暴露第3天，SOD總活性不再存在促進(jìn)作用，但在150 μg/L出現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，之后的各濃度組SOD總活性的下降幅度增大。至第7天，各處理組一致表現(xiàn)出抑制作用，與對(duì)照組相比，差異性極顯著(P<0.01)，基本上呈現(xiàn)一種線性下降趨勢，且下降幅度達(dá)到最大。除了對(duì)照組SOD總活性上升之外，各處理組SOD總活性隨著暴露時(shí)間的延長均表現(xiàn)為抑制作用；至第7天，與對(duì)照組相比，各濃度處理組SOD總活性分別下降了13.80%、24.75%、35.96%、47.82%。

圖10為硫丹對(duì)SOD比活性的影響，由圖可知，孔石莼SOD比活性的變化趨勢于總活性完全不同。各濃度組SOD比活性在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均受到不同程度的促進(jìn)作用，并且在第7天時(shí)250 μg/L處理組受到的促進(jìn)作用最明顯，達(dá)到一個(gè)極顯著的高峰值，與對(duì)照組相比升高了47.29%(P<0.01)。除了第3天各濃度組SOD比活性變化不明顯之外，第1天和第7天各處理組與對(duì)照組相比，均表現(xiàn)出極顯著的差異性(P<0.01)。第1天和第3天，隨著硫丹濃度的增加，SOD比活性有些許下降，變化幅度不明顯；至第七天，隨著濃度的升高SOD比活性出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，與對(duì)照組相比，各濃度組分別上升了5.52%、13.38%、27.57%、17.88%，在350 μg/l處理組時(shí)開始呈現(xiàn)下降趨勢，但仍然高于其他濃度組的比活性。

圖9 硫丹對(duì)孔石莼SOD總活性的影響Fig.9 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on SOD total activityof Ulvapertusa

硫丹對(duì)孔石莼POD總活性的影響如圖11所示，暴露第1天和第3天，孔石莼POD總活性均是出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而在第7天為持續(xù)下降趨勢，且各處理組之間具有顯著性差異(P<0.05)。50 μg/L處理組在第1天POD總活性的達(dá)到最高峰值，與對(duì)照組相比上升了45.53%，說明低濃度的硫丹可以刺激POD酶的活性升高。而第3天則是在150 μg/L處理組出現(xiàn)輕微上升，之后活性立即下降，下降幅度很明顯。至第七天與對(duì)照組相比，各濃度組POD總活性分別下降了18.80%、31.61%、60.48%、70.04%。高濃度處理組250和350 μg/L的POD總活性具有顯著的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，說明高濃度的硫丹脅迫下，會(huì)造成孔石莼的POD酶失活。

圖10 硫丹對(duì)孔石莼SOD比活性的影響Fig.10 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on SOD specific activity of Ulvapertusa

圖11 硫丹對(duì)孔石莼POD總活性的影響Fig.11 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on POD total activityof Ulvapertusa

圖12為硫丹對(duì)孔石莼POD比活性的影響?？资籔OD比活性也呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)作用，高濃度抑制作用。50 μg/L處理組在暴露第一天出現(xiàn)促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比，POD的比活性上升了33.24%。在硫丹暴露第2天，50和150 μg/L濃度組均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比分別升高了6.94%、20.23%。在暴露第7天，50和150 μg/L濃度組與對(duì)照組之間無顯著性差異(P>0.05)。隨著硫丹暴露時(shí)間的延長，150 μg/L濃度組的POD比活性在第三天先升高之后到第7天又下降，但仍然比第1天的比活性高。

圖12 硫丹對(duì)孔石莼POD比活性的影響Fig.12 Effects of treatments with different endosulfan concentrations on POD specific activityof Ulvapertusa

2.3.2 硫丹與pH耦合對(duì)孔石莼抗氧化酶活性的影響 圖14 為pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼SOD比活性的影響。在環(huán)境pH和低pH條件下，孔石莼SOD比活性的變化趨勢表現(xiàn)較為一致，均為先升高再降低。環(huán)境pH條件下，暴露第7天時(shí)250 μg/L處理組出現(xiàn)SOD比活性的峰值，相對(duì)于對(duì)照組增加了27.58%。低pH條件下，暴露第1天時(shí)50 μg/L處理組的SOD比活性先上升隨后開始下降；在暴露第3天和第7天都是在150 μg/L處理組出現(xiàn)峰值，相對(duì)于對(duì)照組分別增加了18.35%和37.18%。在第7天低pH的各處理組除了L-0處理組之外，其他各濃度組與對(duì)照組均有極顯著性差異(P<0.01)。

從pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼SOD活性主體間效應(yīng)分析來看，硫丹對(duì)孔石莼SOD比活性有作用，且在第1天、第3天和第7天均具有極顯著性影響(P<0.01)。pH僅在第3天和第7天對(duì)SOD比活性產(chǎn)生影響。硫丹與pH的交互作用僅在第七天發(fā)揮顯著作用(P<0.05)，第1天和第3天均無顯著影響(P>0.05)。

圖14為pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼POD比活性的影響。在環(huán)境pH和低pH條件下，孔石莼POD的比活性的變化趨勢一致表現(xiàn)為先升高再降低。且POD對(duì)硫丹脅迫的響應(yīng)相較于SOD更加敏感。環(huán)境pH條件下，在暴露第1天時(shí)50 μg/L處理組POD比活性達(dá)到峰值，相對(duì)于對(duì)照組增加了33.22% ；150 μg/L處理組在暴露第3天時(shí)出現(xiàn)峰值，與對(duì)照組相比增加了20.12% ；至第7天各處理組POD比活性沒有明顯升高，高濃度時(shí)顯著降低。低pH條件下，暴露第1天、第3天和第7天均是50 μg/L處理組出現(xiàn)峰值，之后開始下降，相對(duì)于對(duì)照組分別增加了24.07%、33.74%和29.32% 。低pH條件下，除L-0、L-150 μg/L (7 d)、L-250 μg/L(1 d)3個(gè)處理組之外，其他處理組與對(duì)照組相比均有極顯著性差異(P<0.01)。

圖13 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼SOD比活性的影響Fig.13 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on SOD activity of Ulvapertusa

圖14 pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼POD比活性的影響Fig.14 Effects of treatments coupling with different endosulfan concentrations and pH on POD activity of Ulvapertusa

pH與不同濃度硫丹耦合對(duì)孔石莼POD活性主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，硫丹對(duì)孔石莼POD比活性發(fā)揮作用，且在第1天、第3天和第7天均具有極顯著性差異(P<0.01)。pH在上述3個(gè)時(shí)間段對(duì)POD比活性均沒有顯著影響(P>0.05)。硫丹與pH的交互作用在第1天、第3天和第7天均發(fā)揮了作用，對(duì)POD比活性具有極顯著影響(P<0.01)。

3 討論

3.1 硫丹脅迫及與pH耦合對(duì)孔石莼生長的影響

植物的生長狀況會(huì)受諸多外界環(huán)境因素的制約與影響[13]，而生長的響應(yīng)則是一系列生理生化參數(shù)受到脅迫的綜合表現(xiàn)[14]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在高濃度硫丹脅迫下，孔石莼葉片出現(xiàn)嚴(yán)重白化現(xiàn)象，硫丹單獨(dú)脅迫時(shí)，孔石莼的相對(duì)生長率均隨硫丹濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，相對(duì)生長率在硫丹濃度為50 μg/L 時(shí)達(dá)到最高，而暴露時(shí)間進(jìn)一步延長后，硫丹對(duì)孔石莼的生長的促進(jìn)作用逐漸減弱而抑制作用逐漸加深，這也與許多研究者發(fā)現(xiàn)低濃度有機(jī)污染物對(duì)藻類不但沒有毒害作用，反而有促進(jìn)作用的結(jié)論一致。Stebbing[15]認(rèn)為這種增益現(xiàn)象是生物的一種“毒物的興奮效應(yīng)”，是自我保護(hù)的一種機(jī)制有機(jī)污染物促使藻類產(chǎn)生“興奮效應(yīng)”的原因在于低濃度下，毒害和降解兩個(gè)過程同時(shí)存在,其中降解過程占主導(dǎo)地位，因而污染物對(duì)藻類傷害小，而在高濃度硫丹脅迫下，孔石莼的相對(duì)生長率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組并且出現(xiàn)負(fù)增長。這可能是因?yàn)榱虻ぞ哂休^高脂溶性，能滲透到藻體細(xì)胞壁并溶解于細(xì)胞膜中，破壞細(xì)胞的內(nèi)含物組成，進(jìn)而引起細(xì)胞萎縮甚至破裂，宏觀上表現(xiàn)為生長上受到抑制，藻體顏色出現(xiàn)發(fā)白。

pH是影響藻類生長繁殖重要的環(huán)境因子。其對(duì)藻類生長產(chǎn)生的影響取決于光合作用與呼吸作用間的碳收支平衡，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低pH環(huán)境時(shí)孔石莼的相對(duì)生長率高于 pH 為8.2的對(duì)照組；而光合色素含量相對(duì)于對(duì)照組有所下降?？赡苁窃诘?pH 下藻類細(xì)胞的滲透壓調(diào)節(jié)受到干擾，通過細(xì)胞的離子(如K+、Na+)流動(dòng)失控，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，細(xì)胞色素含量下降，光合作用速率降低的同時(shí)呼吸作用受到抑制影響更大。這與文獻(xiàn)中提到的海洋酸化導(dǎo)致海洋生物量的增加，但初級(jí)生產(chǎn)力可能并未有相應(yīng)的增長相一致。

3.2 硫丹脅迫及與pH耦合對(duì)孔石莼光合色素的影響

光合作用色素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是間接反映進(jìn)行光合作用生物的生物量指標(biāo)，其含量變化能較好地反映生物各階段生長發(fā)育正常與否。目前的研究表明，藻類在遭受環(huán)境脅迫時(shí)，反映其光合強(qiáng)度的葉綠素、類胡蘿卜素等色素會(huì)發(fā)生變化[16]，這可能與色素前體的周轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)化有關(guān)。硫丹單獨(dú)脅迫時(shí)，50 μg/L處理組能夠刺激孔石莼體內(nèi)光合色素含量增加，而高濃度硫丹則會(huì)降低光合色素含量，且葉綠素a受到的抑制作用尤其顯著，藻體的光合作用也受到了明顯的抑制作用；而低 pH 與硫丹耦合脅迫的各處理組相對(duì)于僅受硫丹脅迫的各處理組光合色素的含量下降幅度更大，表明 pH 加重了硫丹對(duì)孔石莼的毒性效應(yīng)，兩者關(guān)系表現(xiàn)為協(xié)同作用。其可能的原因是硫丹的理化性質(zhì)受環(huán)境因子pH的影響，在低 pH 環(huán)境下硫丹在水中的半衰期會(huì)增加，降解的更緩慢。因此在低 pH 硫丹處理組中光合色素的含量整體比環(huán)境pH條件下各處理組色素含量低。Alberte[17]認(rèn)為逆境脅迫下葉綠素含量降低的主要原因是葉綠體片層中捕光 Chla/b- Pro 復(fù)合體合成受到抑制。在低濃度硫丹單獨(dú)脅迫時(shí)，孔石莼中3種色素含量都會(huì)增加，這可能是光合色素合成系統(tǒng)對(duì)硫丹毒害的一種應(yīng)激反應(yīng)，可以作為一種有效保護(hù)機(jī)制抵御硫丹對(duì)藻體的毒害，光合色素含量的增加使藻體能夠吸收更多的光能進(jìn)行光合作用，從而為藻體生長代謝提供能量；同時(shí)，類胡蘿卜素可以作為抗氧化劑清除自由基和單線態(tài)氧，防止膜脂的過氧化，維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

光合器官是植物細(xì)胞內(nèi)超氧自由基等的主要來源之一，而光合色素及與之結(jié)合的類囊體膜均具有不飽和多烯結(jié)構(gòu)，極易受 ROS 的攻擊。本實(shí)驗(yàn)中， 350 μg/L的硫丹單獨(dú)脅迫下孔石莼葉綠素a和類胡蘿卜素的含量均有較為明顯的下降，可能是由于孔石莼受硫丹脅迫后，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除間的平衡被破壞，導(dǎo)致活性氧積累，損傷了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。唐學(xué)璽等的研究表明，久效磷脅迫下扁藻葉綠素a的降解與活性氧的損傷有關(guān)[18]。

3.3 硫丹脅迫及與pH耦合對(duì)孔石莼抗氧化酶活性的影響

藻類抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)主要包括SOD、CAT和POD等，超氧化物歧化酶(SOD)是細(xì)胞內(nèi) ROS 清除系統(tǒng)的主要成分，是需氧生物長期進(jìn)化過程中形成的一套復(fù)雜的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的成分之一，與 CAT、POD 等酶抗性系統(tǒng)一起協(xié)同防御活性氧或其他過氧自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害。Wang等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)壬基酚暴露處理 12 天的銅綠微囊藻的GST和SOD 活力均有升高，但是 GST 活力變化比 SOD 活力變化更明顯，認(rèn)為 GST 在消除毒物毒性上貢獻(xiàn)比 SOD 要大[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硫丹單獨(dú)脅迫時(shí)孔石莼體內(nèi)SOD和POD酶活性都是隨著丹濃度的遞增呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在50 μg/L硫丹脅迫下，SOD的總活性升高；50和150 μg/L處理組的POD總活性均有不同程度的上升，并且SOD比活性變化的更顯著。在350 μg/L硫丹脅迫下，SOD和POD的總活性明顯下降，但POD在高濃度脅迫環(huán)境下活性比SOD下降的更低，說明POD對(duì)硫丹脅迫更加敏感。

岳文杰等研究顯示，高濃度的氯氰菊酯脅迫后龍須菜的可溶性蛋白含量受到抑制，本實(shí)驗(yàn)中，孔石莼在高濃度硫丹脅迫下生長受到嚴(yán)重脅迫，可溶性蛋白含量也表現(xiàn)出顯著降低， SOD和POD活性是相對(duì)的增加[20]。Prasad等研究結(jié)果顯示，在硫丹刺激下，絲狀藍(lán)菌的抗氧化酶SOD、CAT、POD的比活性都顯著增強(qiáng)[21]。硫丹濃度為250 μg/L時(shí)，孔石莼SOD的比活性出現(xiàn)上升趨勢，而150 μg/L硫丹處理組的POD活性上升幅度更加明顯。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度硫丹能使藻體產(chǎn)生誘導(dǎo)反應(yīng)，增加抗氧化酶的活性，以抵抗氧化脅迫。而高濃度硫丹脅迫下孔石莼體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)發(fā)生紊亂，抗氧化酶活性降低，使得藻體對(duì)硫丹脅迫的抗性機(jī)制喪失。這些在微藻中也有相同報(bào)道，沈忱等用苯并芘脅迫三種海洋微藻，發(fā)現(xiàn)隨著脅迫時(shí)間的延長 BaP 的誘導(dǎo)作用逐漸消失，表現(xiàn)出抗氧化酶活力先升高后降低的總趨勢[22]。這種現(xiàn)象在其他植物中也有廣泛的報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明孔石莼對(duì)硫丹的脅迫具有一定的耐受能力，輕度脅迫下，孔石莼的抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生適應(yīng)性的誘導(dǎo)反應(yīng)；而當(dāng)外界脅迫加重時(shí)，會(huì)對(duì)抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

當(dāng)硫丹和pH共同脅迫時(shí)，低 pH 硫丹處理組的抗氧化酶的活性對(duì)硫丹的敏感程度與環(huán)境 pH 處理組不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示環(huán)境 pH 處理組SOD 的比活性在250 μg/L時(shí)上升幅度最大，而低 pH 處理組在150 μg/L時(shí)已經(jīng)達(dá)到最大峰值，說明低 pH 條件下SOD 的比活性對(duì)硫丹更加敏感。POD 的比活性在環(huán)境 pH 處理組在硫丹暴露第1天達(dá)到頂峰，低 pH 處理組則在硫丹暴露第3天達(dá)到最大值，說明相對(duì)于環(huán)境 pH 條件，POD 對(duì)硫丹脅迫的敏感性在低 pH 條件下減小。

4 結(jié)論

(1) 硫丹對(duì)孔石莼單獨(dú)脅迫時(shí)，低濃度的硫丹對(duì)孔石莼的生長、光合色素以及抗氧化酶系統(tǒng)都表現(xiàn)出“毒物興奮效應(yīng)”，硫丹濃度為50 μg/L時(shí)促進(jìn)效應(yīng)最為顯著，這是藻類的一種自我保護(hù)機(jī)制。具體表現(xiàn)為相對(duì)生長率升高、光合色素含量增加以及抗氧化酶活性的上升；高濃度硫丹脅迫下，由于活性氧的過量累積，孔石莼的生長代謝過程均受到了不同程度的損害。孔石莼的生長受到抑制，相對(duì)生長率下降甚至出現(xiàn)負(fù)增長，藻體顏色發(fā)白，光合色素含量出現(xiàn)明顯下降，抗氧化酶活性受到顯著抑制。

(2) 硫丹與環(huán)境因子pH耦合實(shí)驗(yàn)中，低pH條件會(huì)促進(jìn)孔石莼的生長，但降低了孔石莼光合色素的含量。在低pH條件下，硫丹對(duì)孔石莼的刺激作用更加顯著，表現(xiàn)為低濃度更加促進(jìn)，高濃度時(shí)抑制作用加劇。低 pH 條件下各處理組抗氧化酶對(duì)硫丹的敏感程度與環(huán)境 pH 處理組不同，SOD對(duì)硫丹更為敏感而POD對(duì)硫丹的敏感性則有所下降。硫丹與pH的交互作用在孔石莼不同生理過程中發(fā)揮的效應(yīng)程度不同，考慮到pH對(duì)硫丹的一些理化性質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生影響，因此在暴露的各階段，孔石莼對(duì)脅迫的響應(yīng)也有所不同。

另外針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中硫丹對(duì)大型海藻在個(gè)體和生理生化上的生態(tài)毒理影響，硫丹分子層面的作用機(jī)理和調(diào)控方式將是本文下一步的研究內(nèi)容。