姚 凱，梁洪生，徐田野，藺 鐵，張相彤

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，哈爾濱 150001)

顱腦損傷是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷性疾病，鈍性創(chuàng)傷或機(jī)械力創(chuàng)傷會(huì)造成暫時(shí)性或永久性腦功能損傷。顱腦損傷是導(dǎo)致全球兒童和青少年死亡和致殘的主要原因之一。引起顱腦損傷的因素主要包括車禍、運(yùn)動(dòng)和暴力等。輕度顱腦損傷也常導(dǎo)致神經(jīng)功能減弱或短暫性受損[1]。顱腦損傷的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括原發(fā)性顱腦損傷和繼發(fā)性顱腦損傷兩個(gè)病理發(fā)展階段。原發(fā)性顱腦損傷是外力直接作用于頭部導(dǎo)致的腦組織損傷，根據(jù)受傷機(jī)制分為局灶性損傷和彌漫性損傷，通常兩種損傷并存。暴力直接作用導(dǎo)致以閉合性顱腦損傷、貫穿傷、擠壓傷為代表的局灶性損傷，主要表現(xiàn)為腦挫裂傷和腦血腫。彌漫性損傷由加速- 減速性損傷通過對(duì)腦組織的旋轉(zhuǎn)以及剪切作用力引起，以彌漫性軸索損傷最常見[2]。繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷后立即發(fā)生，可持續(xù)至損傷后數(shù)周，并可由興奮性毒性、腦水腫、缺血和神經(jīng)炎癥等引起。谷氨酸釋放增加誘導(dǎo)鈣離子進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞，引起一系列病理損害，包括代謝應(yīng)激、線粒體損傷、活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的積累、鈣誘導(dǎo)的鈣蛋白酶水解以及內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元的一氧化氮合酶的激活，導(dǎo)致一氧化氮增加[3]。近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide- binding oligomerization domain- like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體的作用逐漸引起人們的關(guān)注，NLRP3炎癥小體可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與繼發(fā)性顱腦損傷的過程?，F(xiàn)就NLRP3 炎癥小體在顱腦損傷中作用的研究進(jìn)展予以綜述。

1 NLRP3炎癥小體概述

固有免疫是對(duì)病原體入侵的即時(shí)保護(hù)作用和免疫反應(yīng)，包括物理屏障、循環(huán)蛋白(主要是補(bǔ)體系統(tǒng))、免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)以及固有免疫細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體[4]。目前已知的模式識(shí)別受體包括Toll樣受體、RIG- I樣受體、C型凝集素樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide- binding oligomerization domain- like receptor，NLR)4種[5]。NLR是一類細(xì)胞溶質(zhì)傳感器或受體，能夠識(shí)別各種微生物的病原體相關(guān)分子模式，如脂多糖、病毒蛋白、病原體RNA和DNA，還可識(shí)別組織損傷過程中產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式，如ATP和高遷移率族蛋白B1[6]。

研究最廣泛的NLR包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRC5、NLRP6、NLRP7、NLRP12以及稱為黑色素瘤缺乏因子的非NLR，其中NLRP3炎癥小體是研究最多的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥小體，但NLRP3的精確調(diào)控機(jī)制仍不清楚。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白(apoptosis associated speck- like protein，ASC)、銜接蛋白和下游胱天蛋白酶1前體組成[7]。

NLRP3的C端由亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域組成，可能抑制NLR的蛋白功能，使其處于靜息狀態(tài)，NLRP3受到刺激可發(fā)生構(gòu)象改變。中心核苷酸結(jié)構(gòu)域是NLR蛋白的主要功能部位，炎癥小體活化后形成低聚體，N端由熱蛋白結(jié)構(gòu)域組成，通過同型蛋白的相互作用啟動(dòng)下游信號(hào)[8]。當(dāng)受到病原體相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式刺激時(shí)，NLRP3炎癥小體活化,并與ASC通過熱蛋白結(jié)構(gòu)域連接，然后招募胱天蛋白酶1前體，通過胱天蛋白酶募集域連接ASC與胱天蛋白酶1前體，從而產(chǎn)生有活性的胱天蛋白酶1的p10和p20片段[9]。隨后，活化的胱天蛋白酶1將無活性的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β前體和IL- 18前體分別轉(zhuǎn)化為活化和分泌形式的IL- 1β 和IL- 18，細(xì)胞因子啟動(dòng)或擴(kuò)增不同的下游信號(hào)通路，并驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，發(fā)生細(xì)胞焦亡[10]。

2 NLRP3炎癥小體的激活機(jī)制

2.1NLRP3的經(jīng)典激活途徑 經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活需要轉(zhuǎn)錄和低聚反應(yīng)兩個(gè)平行且獨(dú)立的步驟[11]。第一步：受固有免疫信號(hào)調(diào)節(jié)，主要由Toll樣受體髓樣分化因子88或細(xì)胞因子受體，如腫瘤壞死因子受體介導(dǎo)，通過核因子κB活化激活I(lǐng)L- 1β 前體和NLRP3轉(zhuǎn)錄[12]。第二步：NLRP3發(fā)生低聚反應(yīng)活化胱天蛋白酶1，導(dǎo)致IL- 1β和IL- 18的加工和釋放[13]。與感染有關(guān)的各種刺激(包括細(xì)胞外ATP增加、細(xì)胞外滲透壓改變、β淀粉樣蛋白表達(dá)、鉀離子外流、ROS激活以及組織蛋白酶去泛素化)可通過啟動(dòng)NLRP3、銜接蛋白ASC和胱天蛋白酶1前體多蛋白復(fù)合物的合成來促進(jìn)NLRP3炎癥小體的低聚反應(yīng)和活化[14]。研究表明，胱天蛋白酶1能夠切割細(xì)胞焦亡的效應(yīng)蛋白Gasdermin- D(GSDMD)，并將其裂解為GSDMD- N結(jié)構(gòu)域和GSDMD- C結(jié)構(gòu)域，從而破壞C端結(jié)構(gòu)域?qū)SDMD的抑制作用，N端結(jié)構(gòu)域能夠與質(zhì)膜的磷酸肌醇結(jié)合產(chǎn)生內(nèi)徑12～14 nm的膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和裂解，在細(xì)胞焦亡過程中起關(guān)鍵作用[15]。

2.2NLRP3的非經(jīng)典激活途徑 除經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活外，還存在依賴胱天蛋白酶11的非經(jīng)典NLRP3激活途徑，特別是革蘭陰性菌，即檸檬酸桿菌、大腸桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、鼠傷寒沙門菌和霍亂弧菌激活Toll樣受體4- 髓樣分化因子88和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白通路，同時(shí)發(fā)生核因子κB核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)NLRP3炎癥小體各組分以及 IL- 1β 和IL- 18的表達(dá)，促進(jìn)干擾素調(diào)節(jié)因子3和干擾素調(diào)節(jié)因子7基因轉(zhuǎn)錄[16]。隨后，干擾素調(diào)節(jié)因子3/干擾素調(diào)節(jié)因子7復(fù)合物可誘發(fā)α/β干擾素的表達(dá)，并與α/β干擾素受體1和α/β干擾素受體2 結(jié)合，從而激活Jak- STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)胱天蛋白酶11基因的轉(zhuǎn)錄[17]。胱天蛋白酶11前體識(shí)別革蘭陰性菌的脂多糖后，形成脂多糖/胱天蛋白酶11分子復(fù)合體，復(fù)合體低聚化形成非經(jīng)典炎癥小體，并激活脂多糖- 胱天蛋白酶11炎癥小體?；罨碾滋斓鞍酌?1不直接切割促炎細(xì)胞因子前體，而是通過未知機(jī)制激活NLRP3- ASC- 胱天蛋白酶1途徑促進(jìn)IL- 1β的加工和釋放[18]。此外，胱天蛋白酶11能夠?qū)SDMD裂解為C端結(jié)構(gòu)域和 N端結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[15]。

經(jīng)典與非經(jīng)典的NLRP3炎癥小體激活途徑獨(dú)立發(fā)生。胱天蛋白酶11在特定刺激條件下能夠增強(qiáng)經(jīng)典途徑胱天蛋白酶1的活化進(jìn)程，并促進(jìn)IL- 1β和IL- 18的產(chǎn)生[19]。還需要通過進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)對(duì)胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶11之間的相互作用分子機(jī)制以及胱天蛋白酶11激活非經(jīng)典途徑或間接激活經(jīng)典NLRP3炎癥小體途徑的作用機(jī)理進(jìn)行研究。

3 顱腦損傷激活NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

NLRP3炎癥小體通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與顱腦損傷疾病的發(fā)生發(fā)展過程，調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞炎性壞死，其可能成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，固有免疫反應(yīng)在組織損傷或病原體入侵的病理過程中起重要作用，稱為神經(jīng)炎癥反應(yīng)，以小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為主要特征[20]。顱腦損傷后固有免疫反應(yīng)能夠促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)，并加重繼發(fā)性損傷。固有免疫反應(yīng)對(duì)神經(jīng)組織的破壞和修復(fù)主要取決于腦損傷所引起免疫反應(yīng)的性質(zhì)、持續(xù)時(shí)間和級(jí)聯(lián)反應(yīng)的程度[21]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)在顱腦損傷過程中起重要的作用，如果控制不當(dāng)，可能進(jìn)一步加重繼發(fā)性腦損傷，導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)退行性病變，顱內(nèi)高壓、腦水腫甚至腦疝，加劇神經(jīng)功能的缺失[22]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)腦外傷后神經(jīng)炎癥反應(yīng)信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用，有望成為治療顱腦損傷的重要靶點(diǎn)[23]。

嚴(yán)重顱腦損傷患兒腦脊液中NLRP3濃度明顯升高，其濃度在損傷后第一天達(dá)峰值，第二天下降，第三天再次升高，且腦脊液NLRP3濃度較高患兒的預(yù)后較差[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷患者血清樣本中ASC和胱天蛋白酶1的蛋白質(zhì)水平升高，腦脊液樣本中ASC和IL- 18的蛋白質(zhì)水平升高[25]。綜上所述，預(yù)后較差的顱腦損傷患者腦脊液中NLRP3、ASC、IL- 18的以及血液中胱天蛋白酶1的水平均有升高，可見炎癥小體蛋白NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1、IL- 18可作為顱腦損傷患者血清和腦脊液的生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)生物標(biāo)志物含量的變化預(yù)測(cè)顱腦損傷患者的預(yù)后。原發(fā)性損傷或大量神經(jīng)細(xì)胞死亡可能導(dǎo)致早期促炎因子的升高，而后期的促炎因子濃度升高可能與顱內(nèi)壓升高、感染或其他導(dǎo)致炎癥小體激活的觸發(fā)因素引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

Liu等[26]發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷大鼠的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均有大量NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1的表達(dá)，炎癥小體各組分信使RNA及蛋白水平在大鼠顱腦損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)逐漸增加，表明NLRP3炎癥小體在早期顱腦損傷加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)的過程中起重要作用，由此可見，早期顱腦損傷階段炎癥小體信使RNA水平較蛋白水平更敏感。既往有學(xué)者認(rèn)為，小鼠顱腦損傷后NLRP3炎癥小體主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，并不在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[23]。Gustin等[27]研究表明，功能性NLRP3炎癥小體不僅在小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，還在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中表達(dá)。Wei等[28]研究表明，小鼠顱腦損傷后6 h，腦水腫量顯著增加，24 h腦水腫量達(dá)到峰值；且在損傷后24 h，NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1的信使RNA水平和蛋白水平都顯著增加，腦組織中IL- 1β和IL- 18的濃度也增加。由于損傷后腦水腫達(dá)到最高峰時(shí)，NLRP3炎癥小體各個(gè)組分的表達(dá)顯著增加，故推測(cè)NLRP3炎癥小體所調(diào)節(jié)的IL- 1β表達(dá)可能與創(chuàng)傷性腦水腫密切相關(guān)。

4 抑制NLRP3炎癥小體各組分在顱腦損傷中的作用

NLRP3炎癥小體在顱腦損傷中起關(guān)鍵作用，通過使用NLRP3炎癥小體抑制劑或基因敲除炎癥小體蛋白可以阻止NLRP3和ASC寡聚化誘導(dǎo)的胱天蛋白酶1活化，抑制下游促炎細(xì)胞因子IL- 1β和IL- 18的成熟和釋放，從而減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)，并提供神經(jīng)保護(hù)作用。除炎癥小體抑制劑外，一些神經(jīng)保護(hù)劑(如ω- 3脂肪酸)可以通過干擾NLRP3的其他激活途徑抑制其表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ω- 3脂肪酸明顯抑制了控制性皮質(zhì)損傷大鼠的IL- 1β分泌和胱天蛋白酶1活化，ω- 3脂肪酸通過G蛋白偶聯(lián)受體40(G protein- coupled receptor 40，GPR40)抑制控制性皮質(zhì)損傷誘導(dǎo)的炎癥，減少神經(jīng)元死亡，減輕腦水腫和神經(jīng)功能缺失[29]。研究表明，β抑制蛋白2是GPR40的下游蛋白分子，ω- 3脂肪酸可通過激活GPR40和β抑制蛋白2消除NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[30]。GPR40作為ω- 3脂肪酸受體可通過與GPR40結(jié)合抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)。對(duì)NLRP3上游調(diào)節(jié)蛋白GPR40和β抑制蛋白2的探索有望成為新的抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的研究方向。

敲除NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)基因或使用抑制劑能夠降低顱腦損傷小鼠NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和IL- 1β的表達(dá)，減少硫氧還蛋白相互作用蛋白/NLRP3復(fù)合體形成，還可減少神經(jīng)元死亡和損傷灶大小[31]。NOX2通過誘導(dǎo)大量ROS生成激活NLRP3炎癥小體，硫氧還蛋白相互作用蛋白被ROS類激活后與NLRP3結(jié)合，導(dǎo)致NLRP3炎癥小體激活[32]。敲除NOX2基因可以抑制NLPR3炎癥小體激活，可能由NLRP3和硫氧還蛋白相互作用蛋白相互作用減少所致。NLRP3炎癥小體的活化受多種信號(hào)調(diào)節(jié)，其中線粒體功能障礙導(dǎo)致產(chǎn)生的ROS對(duì)NLRP3的激活非常重要，ROS的活化被認(rèn)為是組裝NLRP3炎癥小體的上游活性信號(hào)，可見NOX2/硫氧還蛋白相互作用蛋白/NLRP3的相互作用可能是NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。

有研究表明，ASC抗體可干預(yù)液壓沖擊傷大鼠炎癥小體的合成，并顯著減少胱天蛋白酶1和IL- 1β的活化，從而縮小大鼠腦組織損傷灶的體積[33]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，胱天蛋白酶1抑制劑(Ac- YVAD- cmk)可抑制顱腦損傷小鼠的炎癥小體中關(guān)鍵亞基胱天蛋白酶1以及下游促炎因子IL- 1β、IL- 18的釋放，胱天蛋白酶1抑制劑還可降低裂解的GSDMD的表達(dá)，從而減少細(xì)胞焦亡[34]。

NLRP3炎癥小體是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要復(fù)合體，炎癥小體銜接蛋白ASC抗體和胱天蛋白酶1抑制劑都可以阻斷炎癥小體的活性。細(xì)胞焦亡是一種依賴胱天蛋白酶1的炎癥細(xì)胞壞死，可能是顱腦損傷后最主要的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式。因此，抑制焦亡可能減輕顱腦損傷導(dǎo)致的血腦屏障破壞、腦水腫和炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。新的治療靶點(diǎn)可為顱腦損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)提供新的治療方式。

5 NLRP3炎癥小體下游炎癥因子在顱腦損傷中的作用

IL- 1β和IL- 18與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，NLRP3 炎癥小體可通過促進(jìn)下游炎癥因子IL- 1β和IL- 18釋放誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。研究表明，IL- 1β與顱腦損傷后腦水腫的形成有關(guān)，可進(jìn)一步破壞血腦屏障，并活化炎癥細(xì)胞[28]。因此，IL- 1β作為NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的下游炎癥因子，其產(chǎn)生加劇了顱腦外傷后炎癥引起的繼發(fā)性損害。盡管生物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)作為天然防御反應(yīng)具有保護(hù)作用，但是促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生可能成為組織損傷的重要驅(qū)動(dòng)力。因此，抑制過度炎癥反應(yīng)是改善顱腦損傷后神經(jīng)功能必不可少的條件[35]。

對(duì)顱腦損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯堪l(fā)現(xiàn)，升高的IL- 1β與腦損傷后腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)[36]。研究表明，顱腦損傷后大鼠的大腦皮質(zhì)中IL- 1β的濃度顯著升高，而IL- 18的濃度在損傷后的6 h才逐漸增加，高滲0.9%氯化鈉注射液能夠抑制IL- 1β和IL- 18的表達(dá)，并減輕腦組織水腫程度，高滲0.9%氯化鈉注射液可能通過降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中的Na- K- Cl 聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，從而減少IL- 1β的分泌，降低腦水腫程度[37]。IL- 1β和IL- 18均由炎癥小體產(chǎn)生，在損傷的不同階段具有不同的作用。

Flygt等[38]的研究表明，IL- 1β中和抗體能夠抑制液壓沖擊傷引起的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的激活，減少成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，改善所觀察到的神經(jīng)行為。IL- 1β作為一種最常見的促炎因子，通過IL- 1β中和抗體抑制其分泌已在顱腦損傷治療中取得了顯著進(jìn)展。

目前重組IL- 1受體拮抗劑阿那白滯素正處于臨床試驗(yàn)階段，在腦卒中患者的治療中顯示出一定的治療前景，應(yīng)繼續(xù)探索其在嚴(yán)重顱腦損傷患者治療中的抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用[39]。目前，仍需對(duì)拮抗劑進(jìn)一步的研究，以便了解其臨床使用的優(yōu)勢(shì)和不足，并探索后期顱腦損傷患者臨床試驗(yàn)及生物安全。

6 小 結(jié)

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫反應(yīng)，在繼發(fā)性顱腦損傷階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。神經(jīng)炎癥過程具有雙重作用，既可通過更新再生組織而獲益，也可通過放大局部炎癥而產(chǎn)生有害作用。炎癥小體可以通過擴(kuò)大炎癥反應(yīng)信號(hào)誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，故炎癥抑制劑和靶向炎癥小體藥物有望對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病得以治療起主要作用。NLRP3炎癥小體抑制劑可通過抑制IL- 1β和IL- 18的分泌和活化調(diào)節(jié)促炎途徑。未來還需要對(duì)NLRP3炎癥小體各組分的活化和調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究，并側(cè)重于對(duì)NLRP3炎癥小體上游分子的研究，有效干預(yù)NLRP3炎癥小體的組裝，從而減少神經(jīng)功能損害。