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      一例腹腔漿膜炎型豬鏈球菌病的診斷與防治

      2019-02-26 05:33:20蔣增海王揚(yáng)偉張桂榮鄧同煒盧建洲
      豬業(yè)科學(xué) 2019年1期
      關(guān)鍵詞:豬鏈球菌漿膜瓊脂

      蔣增海,王揚(yáng)偉,張桂榮,鄧同煒,盧建洲

      (河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450046;河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046)

      豬鏈球菌病是鏈球菌屬中馬鏈球菌獸疫亞種、馬鏈球菌類馬亞種、Lancefied分群中D、E、L群鏈球菌以及豬鏈球菌引起豬的疫病的總稱,臨床上主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及敗血癥等癥狀,其中,豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引致豬鏈球菌病最主要的病原[1]。

      根據(jù)豬鏈球菌病莢膜多糖抗原的不同,可以將其分為35種血清型(血清型1~34和血清型1/2),其中致病力最強(qiáng)的豬鏈球菌病2型是一種重要的人畜共患病病原,可通過呼吸道、消化道或皮膚傷口等途徑感染人,從而對人類健康和生命安全構(gòu)成潛在的危害[2]。在荷蘭,豬鏈球菌2型引起各類臨床癥狀中,42%為肺炎,18%為腦膜炎和心內(nèi)膜炎,10%多發(fā)性漿膜炎[1]。豬鏈球菌病常常與其他豬病如巴氏桿菌病、副豬嗜血桿菌病、豬瘟、豬偽狂犬病等混合感染[3-7],增加診斷難度,造成更為嚴(yán)重的危害。近年來,全國各地時(shí)常有豬鏈球菌病的報(bào)道[3-8],但是未見腹腔漿膜炎型豬鏈球菌病的報(bào)道。

      2018年5 月,河南新密某養(yǎng)豬場,飼養(yǎng)黑豬19頭,體重40?kg左右,1周之內(nèi),連續(xù)5頭仔豬發(fā)病,使用頭孢噻呋鈉,治愈3頭,死亡2頭。臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振,體溫升高,呼吸急促,食欲下降,甚至不食,病初糞便干結(jié),后期腹瀉。病死豬剖解,可見頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血(圖1、圖2),肺臟出血(圖3),肝臟、脾臟、腸道表面大量蜘蛛網(wǎng)狀的纖維素性物質(zhì)覆蓋(圖4、圖5)。為了診斷與控制該病,課題組采集病料,進(jìn)行了細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn),現(xiàn)報(bào)告如下。

      1 材料與方法

      1.1 主要試劑

      胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)、煙酰胺腺 嘌 呤 二 核 苷 酸(NAD)、5%鮮血瓊脂平板、腦心浸液肉湯、2x?PCR?Taq?Master?Mix?with?dye、DNA?Marker?DL2?000、核酸染料、各種藥敏片、快速革蘭氏染色液。

      1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

      無菌采集肺臟、心血,或者棉簽直接涂抹肝臟或者脾臟漿膜面,接種于TSA瓊脂平板(含終濃度為5%的新生牛血清、10μg/mL?NAD),37℃培養(yǎng)24~48?h,進(jìn)一步純化傳2~3代。將分離菌株,接種于血瓊脂平板,37?℃培養(yǎng)24~48?h,觀察生長情況。

      1.3 染色、鏡檢

      取潔凈玻片,滴一滴無菌蒸餾水于玻片中央,挑取純化后的分離菌株單菌落,涂抹于蒸餾水中,混合,自然干燥后,火焰上固定,按照快速革蘭氏染色說明書要求,進(jìn)行染色。油鏡下,觀察分離菌株的形態(tài)特征。

      1.4 PCR 檢測

      將分離菌株接種于TSB(含終濃度為5%的新生牛血清),過夜培養(yǎng),水煮沸法提取分離菌株DNA模板。參考文獻(xiàn)[9]合成一對鏈球菌擴(kuò)增特異性引物(P1:GCAGCGTATTCTGTCAAACG,P2:CCATGGACAGATAAAGATGG,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為689?bp),采用PCR法對分離菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳后,凝膠成像系統(tǒng)檢測擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小是否一致。

      1.5 藥敏試驗(yàn)

      采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法,對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株接種于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng)。比濁法將菌液濃度,先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×108CFU/mL)。用滅菌棉簽,蘸取稀釋好分離菌液,緊貼試管內(nèi)壁在液體上方旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次,這樣能除去棉簽上多余的液體,然后均勻涂抹于血瓊脂平板,蓋子可半開3~5?min,使得瓊脂吸取多余水分。將藥敏紙片貼于平板上,藥敏片之間的距離以1~2?cm為宜,藥敏紙片距平皿邊緣約1.5?cm,置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24?h后,測定抑菌圈的直徑。參照2013版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical?and?Laboratory?Standards?Institute,CLSI)手冊解釋標(biāo)準(zhǔn)[10]對藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

      圖1 頜下淋巴結(jié)腫大出血

      圖2 腹股溝淋巴結(jié)腫大出血

      圖3 肺臟出血

      圖4 肝臟、腸管覆蓋纖維素性物質(zhì)

      圖5 脾臟、腸管覆蓋纖維素性物質(zhì)

      2 結(jié)果

      2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

      無菌采集肺臟、心血,或者棉簽直接涂抹肝臟或者脾臟漿膜面,接種于TSA瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24~48?h,生長為圓形、白色、針尖大小菌落,菌落很純,無雜菌(圖6)。將分離菌株,接種于血瓊脂平板后,同樣生長為圓形、針尖大小菌落,呈α溶血(草綠色溶血)(圖 7)。

      2.2 染色、鏡檢

      將分離菌株革蘭氏染色后,油鏡下放大1?000倍觀察,菌體呈革蘭氏陽性,球形,鏈狀排列(圖8)。

      2.3 PCR 檢測結(jié)果

      水煮法提取DNA模板,采用PCR法擴(kuò)增豬鏈球菌特異性片段,擴(kuò)增結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段大?。▓D9)與預(yù)期大小689?bp一致,表明分離菌株為豬鏈球菌。

      2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

      選取10種抗菌藥物,采取K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法,對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對青霉素類、四環(huán)素類藥物、喹諾酮可藥物、大環(huán)內(nèi)脂內(nèi)藥物均敏感,對林可胺、氯霉素類藥物耐藥(表1)。通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果,我們可以看出,養(yǎng)殖戶選擇頭孢噻呋鈉治療,應(yīng)該是可行的,因?yàn)轭^孢噻呋鈉一般比青霉素類藥物更有效。

      圖6 TSA平板白色、圓形菌落

      圖7 血瓊脂平板生長的圓形、白色、α溶血菌落

      圖8 分離菌株革蘭氏陽性,球形,鏈狀排列

      圖9 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

      表?1?分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

      3 討論與分析

      豬鏈球菌病是一種人畜共患傳染病,世界上廣泛分布,在臨床上主要引起敗血型、腦膜炎型、關(guān)節(jié)炎型和淋巴結(jié)化膿型。本次病例,通過細(xì)菌分離、染色鏡檢形態(tài)觀察和PCR檢測,確診為豬鏈球菌??;根據(jù)腹腔肝臟、脾臟和腸管覆蓋大量纖維素性物質(zhì),判定為漿膜炎型豬鏈球菌病。該類型豬鏈球菌病,在臨床上容易被誤診為副豬嗜血桿菌病,應(yīng)引起廣大獸醫(yī)工作者和養(yǎng)殖戶重視,注意鑒別診斷。

      通過藥敏試驗(yàn),分離菌株對林可霉素和氯霉素耐藥,由于氯霉素在我國禁止使用,推測與氯霉素同類的藥物氟苯尼考對分離菌株具有耐藥性,如果使用這些藥物治療,會(huì)導(dǎo)致治療失??;分離菌株對青霉素、阿莫西林、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星均敏感。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,我們指導(dǎo)養(yǎng)殖戶,強(qiáng)力霉素拌料飼喂5~7?d,發(fā)病豬只使用大劑量青霉素肌肉注射,很快控制病情。

      本次試驗(yàn)中,選擇TSA瓊脂平板(含終濃度為5%的新生牛血清、10μg/mL?NAD)作為分離病原菌的培養(yǎng)基,是因?yàn)樵撆囵B(yǎng)基適合多種豬病原細(xì)菌的生長,例如副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬丹毒桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等。試驗(yàn)中均未分離到上述病原菌,進(jìn)一步確診本次發(fā)病是由豬鏈球菌引起,無其他病原菌混合感染。

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