賴圳登綜述，包倪榮，趙建寧審校

0 引 言

生物鐘是指生命體內(nèi)多種具有內(nèi)在節(jié)律的基因調(diào)控相應(yīng)的蛋白表達(dá)，影響細(xì)胞、組織、系統(tǒng)、器官的活性與功能，使得在不同時(shí)間段活性與功能有所不同。Hall、Rosbash以及Young三位科學(xué)家首先在果蠅的體內(nèi)分離出“時(shí)間基因”（Period gene）［1-2］。且Jeffrey和Rosbash發(fā)現(xiàn)了時(shí)間基因可轉(zhuǎn)錄、翻譯成“時(shí)間蛋白”（period protein，PER）。此蛋白是果蠅體內(nèi)一種具有在夜間累積、在白晝分解的具有明顯周期性的擺動(dòng)蛋白，且周期為24 h。Young發(fā)現(xiàn)了第二種時(shí)間基因“Timeless 基因”（TIM）［3］，可轉(zhuǎn)錄、翻譯成TIM蛋白。Young在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TIM蛋白會結(jié)合到PER蛋白上，一起進(jìn)入細(xì)胞核，共同起到抑制PER基因的活性作用。進(jìn)一步研究后，Young又發(fā)現(xiàn)一個(gè)生物節(jié)律基因，稱為“延時(shí)基因”（Doubletime gene）［4］，這個(gè)基因編碼的 DBT 蛋白又可延遲PER蛋白的積累，讓PER蛋白增加和減少的周期固定在24小時(shí)左右。至此，果蠅生物鐘的分子運(yùn)作機(jī)制基本明確。日裔科學(xué)家高橋用小鼠做實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的生物時(shí)鐘基因——Clock基因和其編碼產(chǎn)生的CKIε蛋白（激酶）［5］，才比較完整地解釋了人和哺乳動(dòng)物的生物鐘，也比較清楚地說明該生物時(shí)鐘是由Clock基因及CKIε蛋白、PER基因及其蛋白、TIM基因及其蛋白、DBT基因及其蛋白這4種基因和蛋白共同作用，形成了哺乳動(dòng)物和人的24小時(shí)生物晝夜節(jié)律，且周期震蕩性由視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）控制。肩袖損傷被認(rèn)為是人類肌肉組織自然衰退的表現(xiàn)，肩袖撕裂的危險(xiǎn)因素包括創(chuàng)傷史，優(yōu)勢臂和年齡［6］。隨著年齡增長尤其在50歲之后，肩袖損傷極其常見。30%～70%的肩關(guān)節(jié)疼痛均與肩袖損傷有關(guān)，其發(fā)病率占肩關(guān)節(jié)損傷的5%～40%［7］。有多種因素可引起肩袖損傷，結(jié)合早期研究與近期研究，內(nèi)在因素主要有灌注減弱、退行性改變、退行性輕微損傷、內(nèi)分泌因素、代謝因素、細(xì)胞凋亡、TGs表達(dá)減弱、MMPs失調(diào)等；外在因素主要有慢性炎性浸潤、輕微損傷、急性損傷、多因素?fù)p傷［7］。其中，Neer等［8］在1972年提出肩峰撞擊學(xué)說，并認(rèn)為95%的肩袖損傷是肩峰下撞擊所致。Neer等［9］提出肩關(guān)節(jié)撞擊征發(fā)展過程分為可逆階段、不可逆階段和肌腱斷裂，這是一種慢性炎癥浸潤的過程。這一觀點(diǎn)受到廣泛認(rèn)同，近期有研究人員在大鼠肩峰處植入以PEEK為材料的3D打印植入物后驅(qū)趕大鼠跑臺，每天跑臺一次，一次30 min，持續(xù)2～8周以模擬肩峰撞擊征，分別在第二周、第四周、第六周、第八周處死大鼠并得到的病理結(jié)果成階段性炎性發(fā)展而且最終發(fā)展為肌腱全層撕裂［10］。肩袖損傷患者的頸肩部疼痛以夜間疼痛加劇白晝疼痛緩解為特殊臨床表現(xiàn)，且91%年齡超過65歲的肩袖損傷患者都有夜間疼痛［11］。患者夜間出現(xiàn)明顯的劇烈肩部疼痛，位置常在肩峰下方。反復(fù)不規(guī)則的頸肩部疼痛使得患者十分痛苦，無法患側(cè)臥位，大部分不能或不敢做伸肘屈肩抬臂等動(dòng)作，嚴(yán)重影響睡眠。

1 肩袖損傷夜間疼痛的形成機(jī)制

1.1 神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)夜間活躍神經(jīng)源性炎癥是由小直徑感覺神經(jīng)元C-5纖維受到傷害性刺激后釋放神經(jīng)肽于外周組織并作用于內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、免疫細(xì)胞及血管平滑肌等，繼而引起外周組織血管擴(kuò)張、局部充血、血流量增加且血管通透性增強(qiáng)、血漿蛋白滲出，引起組織水腫，表現(xiàn)為局部紅、腫、熱及痛覺過敏［12］?，F(xiàn)研究認(rèn)為肩峰下滑囊炎癥反應(yīng)是肩袖損傷產(chǎn)生疼痛的主要原因，且疼痛的程度與肩峰下滑囊炎癥程度呈正相關(guān)［13］。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素1（Interleukin1，IL-1）、IL-1β、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase1，MMP-1）、MMP-9、環(huán)氧化酶1（Cyclooxygenase1，COX-1）、COX-2、P物質(zhì)等在肩袖損傷患者的滑囊組織中高表達(dá)。上述高表達(dá)物質(zhì)中，P物質(zhì)是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，參與神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，而其中COX-2已被證實(shí)是調(diào)節(jié)外周ephrinBs/EphBs信號激活引起的痛覺所必須的［14］，其余因子與NF-kB激活的炎癥反應(yīng)相關(guān)。另有研究通過多普勒超聲檢查發(fā)現(xiàn)，肩袖損傷患者的旋肱前動(dòng)脈血流量夜間較白晝明顯增多［15］，也進(jìn)一步證明肩袖損傷患者肩峰下滑囊內(nèi)由NF-kB激活的炎癥反應(yīng)以及COX-1等物質(zhì)起到的擴(kuò)張血管，增加血流量的作用是具有晝夜節(jié)律性的。

1.2 繼發(fā)性外周及中樞敏化肩袖損傷的袖口撕裂多為創(chuàng)傷性與退行性，創(chuàng)傷性撕裂是由于明顯的創(chuàng)傷，而退行性疾病則更加常見［16］。由于外在因素和內(nèi)在因素的影響，導(dǎo)致鞘肌腱逐漸衰竭，伴有或不伴有疊加的急性損傷，最終會導(dǎo)致全層撕裂，并損傷周圍細(xì)胞。損傷細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞將釋放神經(jīng)遞質(zhì)，如P物質(zhì)、降鈣素相關(guān)肽等進(jìn)一步導(dǎo)致外周傳入纖維痛閾值下降，使得外周細(xì)胞對痛覺敏感化。長期組織水腫如未及時(shí)改善將繼發(fā)性地誘發(fā)中樞敏化［17］，即肩袖損傷患者在外周傷害信息的持續(xù)輸入條件下，將調(diào)控脊髓背角中的痛覺傳遞神經(jīng)元，使其突觸的興奮性增加、發(fā)放閾下降，產(chǎn)生痛覺過敏、痛覺超敏以及痛覺感知范圍增大，使得疼痛加劇［18］。此種神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)造成的繼發(fā)性外周及中樞敏化在夜間表現(xiàn)更為明顯。

1.3 褪黑激素起到重要作用最新研究表明，肩部夜間痛與人體大腦分泌的一種叫褪黑素的物質(zhì)有關(guān)［19］，褪黑激素的分泌具有明顯周期性:白天分泌少、晚上分泌多。夜間和清晨的褪黑激素水平峰值可能會激活炎癥反應(yīng)，并可能導(dǎo)致夜間疼痛程度增加［20-21］。肩袖撕裂損傷時(shí)，周圍組織褪黑素受體明顯增加，更多的褪黑素與周圍的褪黑素受體結(jié)合，可使局部炎癥介質(zhì)釋放增加。而目前研究認(rèn)為褪黑激素受體在痛覺信息的傳輸中起到重要作用［22-23］。褪黑激素可能在肩袖撕裂中起到夜間疼痛的介質(zhì)的作用，這種作用可能是通過褪黑激素受體介導(dǎo)的。其具體機(jī)制需要更多的研究證實(shí)。

1.4 受到肩關(guān)節(jié)解剖學(xué)影響肩袖損傷患者夜間疼痛的表現(xiàn)與解剖學(xué)因素密切相關(guān)，長期慢性卡壓造成的肩袖損傷，患者的肩關(guān)節(jié)滑囊常發(fā)生粘連、肌肉攣縮，尤其以肩峰下滑囊、三角肌下滑囊、肩胛下肌下滑囊最為明顯，盂肱關(guān)節(jié)變得僵硬，繼而使肩胛骨外展。患者入睡時(shí)，外展的肩胛骨受到擠壓沿著胸壁向后、向內(nèi)運(yùn)動(dòng)，使得原本僵硬的盂肱關(guān)節(jié)過度拉伸，其關(guān)節(jié)囊張力增加，關(guān)節(jié)囊上的自由神經(jīng)末梢受到刺激出現(xiàn)疼痛。另外，患者入睡時(shí)，常自然出現(xiàn)側(cè)臥位，患側(cè)肩關(guān)節(jié)外展并內(nèi)旋，位于岡上肌腱前緣和肩胛下肌腱上緣的肩袖間隙會與前方的喙突尖部發(fā)生撞擊引發(fā)疼痛［24-25］。

2 生物鐘在關(guān)節(jié)疾病中扮演重要角色

2.1 生物鐘與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的癥狀經(jīng)常顯示晝夜變化，如關(guān)節(jié)僵硬和關(guān)節(jié)痛在早晨惡化。這是RA的癥狀隨著RA介導(dǎo)細(xì)胞因子的循環(huán)濃度的每日振蕩而變化的表現(xiàn)。特別是可受到免疫細(xì)胞調(diào)控的IL-6顯示出強(qiáng)烈的分子振蕩性，而血清IL-6水平的波動(dòng)與疾病癥狀的變化相關(guān)。迄今為止，RA中驅(qū)動(dòng)晝夜節(jié)律疾病表達(dá)的顯性細(xì)胞類型仍未確定。可能成為節(jié)律性IL-6分泌基礎(chǔ)的候選者之一是CD4+T淋巴細(xì)胞，研究顯示CD4+T淋巴細(xì)胞具有晝夜節(jié)律振蕩性，是通過改變細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌所體現(xiàn)的［26］。故其被認(rèn)為是RA的關(guān)鍵介質(zhì)，在疾病發(fā)生和持續(xù)中具有一定的作用。

此外，巨噬細(xì)胞具有內(nèi)在時(shí)鐘，超過8%的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組受到晝夜控制［27］。盡管認(rèn)為巨噬細(xì)胞不參與RA的起始，但其促炎和組織破壞作用有助于疾病表達(dá)，且這些吞噬細(xì)胞在糜爛性疾病中介導(dǎo)炎癥和組織破壞中的關(guān)節(jié)。最近的一項(xiàng)研究表明IL-6對人和小鼠巨噬細(xì)胞的刺激有節(jié)奏，并確定了時(shí)鐘基因（和核受體）rev-erbα在產(chǎn)生這些節(jié)律中的重要性［28］。最后，位于滑膜內(nèi)膜襯里內(nèi)的類似滑膜細(xì)胞的成纖維細(xì)胞也有晝夜節(jié)律振蕩。這些細(xì)胞是RA中促炎細(xì)胞因子的主要來源，盡管在活動(dòng)性疾病中它們可能不再振蕩。

總之，免疫系統(tǒng)的各個(gè)細(xì)胞成分啟動(dòng)并持續(xù)存在炎癥通路是受到生物鐘嚴(yán)格調(diào)節(jié)的。許多候選細(xì)胞可以協(xié)調(diào)IL-6分泌中的晝夜節(jié)律振蕩性。然而，發(fā)揮這種時(shí)鐘控制的機(jī)制尚未完全建立。

2.2 生物鐘與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎晝夜節(jié)律功能障礙與許多疾病有關(guān)，其中包括關(guān)節(jié)軟骨動(dòng)態(tài)平衡和骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的病理生理學(xué)作用。最近一項(xiàng)研究用小鼠測試了晝夜穩(wěn)態(tài)的環(huán)境或遺傳破壞是否傾向于OA樣病理變化［29］。該研究分別在光照（Light，L）:黑暗（Dark，D）循環(huán)和晝夜節(jié)律遺傳破壞的條件下觀察雄性小鼠的晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。將野生型（Wide type，WT）小鼠隨機(jī)分兩組，一組維持恒定的12小時(shí)L:12小時(shí)D循環(huán)，另一組暴露于每周12小時(shí)相移。另外，將雄性晝夜節(jié)律突變小鼠（ClockΔ19或Csnk1etau突變體）與年齡匹配的WT同窩小鼠進(jìn)行比較，所述WT同窩小鼠維持在恒定的12小時(shí)L:12小時(shí)D循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn):晝夜節(jié)律的環(huán)境破壞通過抑制蛋白多糖積累，上調(diào)基質(zhì)降解酶和下調(diào)小鼠膝關(guān)節(jié)中的合成代謝介質(zhì)來促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的改變。

從機(jī)制上講，這些作用涉及PKCδ-ERK-RUNX2/NFκB和β-catenin信號通路的激活，包括基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）和聚蛋白多糖酶5（ADAMTS-5）的刺激，以及相關(guān)軟骨細(xì)胞中合成代謝介質(zhì)SOX9和TIMP-3的抑制。時(shí)相移位的小鼠其晝夜節(jié)律穩(wěn)態(tài)的遺傳破壞不易導(dǎo)致關(guān)節(jié)中OA樣病變。該研究結(jié)果首次提供了令人信服的體內(nèi)證據(jù)，即晝夜節(jié)律的環(huán)境破壞是小鼠膝關(guān)節(jié)OA樣病變的發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

2.3 生物鐘與肩周炎與肩袖損傷相似，雖然致病機(jī)理不同，但是肩周炎患者夜間疼痛顯著，睡眠受到嚴(yán)重影響，長期的睡眠不足常導(dǎo)致患者易怒和抑郁［30］。有研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素可能在肩周炎產(chǎn)生夜間痛的機(jī)制中發(fā)揮一定作用。褪黑激素是由腦松果體分泌的吲哚雜環(huán)類化合物，在調(diào)節(jié)生理周期、免疫、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及疼痛調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，其分泌具有明顯的晝夜節(jié)律，夜間分泌量顯著高于白天。

Ha等［19］通過對比肩袖損傷患者、肩周炎患者和正常人的肩峰下滑囊和關(guān)節(jié)囊組織發(fā)現(xiàn)，在肩袖損傷和肩周炎患者肩峰下滑囊和關(guān)節(jié)囊組織中，褪黑素受體1A（MTNR1A）、褪黑素受體1B（MTNR1B）及敏感離子通道3（ASIC3）的表達(dá)明顯升高。同時(shí)，Ha等［19］還進(jìn)行了體外成纖維樣滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10nM濃度的褪黑素能夠誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞表達(dá)ASIC3及炎癥介質(zhì)IL-6，通過褪黑素受體拮抗劑處理后能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。他們還發(fā)現(xiàn)炎癥介質(zhì)IL-1β，TNF-α能夠誘導(dǎo)MTNR1A及MTNR1B表達(dá)，褪黑素對炎癥介質(zhì)的釋放具有重要的調(diào)節(jié)作用，褪黑素可能通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放對MTNR1A及MTNR1B的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者認(rèn)為夜間褪黑素分泌增加，通過作用于褪黑素受體及ASIC3對肩周炎和肩袖損傷患者產(chǎn)生夜間疼痛有重要作用。但是，這一猜想仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)語與展望

臨床中，反復(fù)夜間疼痛是肩袖損傷患者的常見就診原因、主要臨床表現(xiàn)同時(shí)也是術(shù)后常見癥狀之一。然而，產(chǎn)生這一癥狀的原因并不明確。目前的研究成果表明生物鐘在代謝、機(jī)體炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)中具有重要意義，且在許多關(guān)節(jié)疾病中扮演重要角色。近期，有研究指出狒狒體內(nèi)，許多組織類型和大腦區(qū)域中有近80%的基因活動(dòng)都遵循晝夜節(jié)律［31］，提示生物鐘可影響對疾病機(jī)制的理解并提出優(yōu)化的療法?？茖W(xué)家自發(fā)現(xiàn)生物鐘至今，對生物鐘的研究不乏與骨科、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)相關(guān)，目前研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素分泌增加可能與肩關(guān)節(jié)夜間疼痛加劇有關(guān)，其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步證實(shí)。若想確定肩袖損傷患者表現(xiàn)出的夜間疼痛是否具有晝夜節(jié)律性，至少還需要證明以下幾點(diǎn):①已經(jīng)找到肩袖損傷的炎癥反應(yīng)中某種或多種特殊的炎癥因子，或肩袖損傷引起的免疫系統(tǒng)功能變化關(guān)鍵因子；②證明其參與肩袖損傷產(chǎn)生疼痛的途徑及相關(guān)作用機(jī)制；③從基因?qū)用孀C明這種特殊的炎癥因子或免疫因子在肩袖損傷患者體內(nèi)具有分子振蕩性；④這種分子振蕩周期與SCN具有同步的節(jié)律性。若經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，肩袖損傷的夜間疼痛特殊臨床表現(xiàn)符合以上4點(diǎn)，則可說明其具有晝夜節(jié)律性。綜上所述，肩袖損傷患者的夜間疼痛臨床表現(xiàn)與人體生物鐘存在一定聯(lián)系，探討其作用機(jī)制對臨床診斷、治療及新藥研究有指導(dǎo)作用。