姚天華　KrishnaRegmi　杜婧婷

[摘要]目的：通過不同濃度的普萘洛爾干預(yù)體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，探討B(tài)ax基因在普萘洛爾誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。方法：體外培養(yǎng)人增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，分別加入不同濃度的普萘洛爾藥物干預(yù)，選擇適宜的研究濃度及觀察時間。構(gòu)建Bax基因高表達(dá)及低表達(dá)組，檢測其表達(dá)差異對于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：經(jīng)普萘洛爾干預(yù)后細(xì)胞呈凋亡形態(tài)學(xué)改變，且隨著藥物濃度和藥物作用時間的增加，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)增加，其中300μmol/L的普萘洛爾干預(yù)24h時細(xì)胞凋亡率為28.49%，此為本實(shí)驗(yàn)中普萘洛爾誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的最佳藥物濃度和時間點(diǎn)。Bax高表達(dá)組細(xì)胞構(gòu)建成功后，經(jīng)普萘洛爾干預(yù)，BAM7+普萘洛爾組>DMSO+普萘洛爾組>普萘洛爾組>BAM7組>空白對照組。Bax低表達(dá)組構(gòu)建成功后，經(jīng)普萘洛爾干預(yù)，Bax siRNA+普萘洛爾組>N.C siRNA+普萘洛爾組>轉(zhuǎn)染試劑+普萘洛爾組>普萘洛爾組>空白對照組。結(jié)論：300μmol/L的普萘洛爾干預(yù)24h，是普萘洛爾誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的最佳藥物濃度和時間點(diǎn)。Bax與普萘洛爾誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Bax表達(dá)量越高，普萘洛爾誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的能力越強(qiáng)，Bax表達(dá)量降低，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡無明顯變化。

[關(guān)鍵詞]普萘洛爾；血管瘤；凋亡；Bax；BAM7；siRNA

[中圖分類號]R732.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2019）01-0100-05

The Effect of Bax on Propranolo Induced Hemangioma Endothelial Cell Apoptosis

YAO Tian-hua1，2，KRISHNA Regmi1，3，DU Jing-ting4，SHI Jing-yi1，3，HU Xiao-yi1，3，LI Li-feng1，3，TU Jun-bo1，3

（1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research；2.Department of General Dentistry；3.Department of Oral Maxillofacial Surgery，Xi'an Jiaotong University Stomatology Hospital，Xian 710004，Shaanxi，China；4.Department of Stomatology，People's Hospital of Zaozhuang，Zaozhuang 277000，

Shandong，China）

Abstract： Objective Hemangioma endothelial cell （HemEC） which is cultured in vitro is intervened by different concentrations of propranolol. To verify the effect of Bax on propranolo induced HemEC apoptosis. Methods Different concentrations of propranolol were added to HemEC which was cultured in vitro， select the most meaningful group and time point. Adopt the Bax activator to build the high model and the low expression group. The effect of expression difference on apoptosis of endothelial cells in hemangioma was detected. Results After intervented， the HemECs performanced apoptotic morphological changes， as the drug concentration and the intervention time increased， the apoptosis rate increased too. The intervention factors that be intervented by 300μmol/L after 24 hours which apoptosis rate was 28.49% is believed to be significance. With the high expression of Bax mRNA，after propranolol intervention， BAM7+propranolol>DMSO+propranolol>propranolol>BAM7>control group. With the low expression groups，after propranolol intervention， Bax siRNA+propranolol>N.C siRNA+ propranolol>transfection reagent+propranolol>propranolol>control group. Conclusion The optimal concentration and time point of pronaphthol in inducing apoptosis of endothelial cells in hemangioma was 300 mol/L of pronaphthol intervention for 24 hours.Bax gene is closely related with HemEC apoptosis induced by propranolol， the higher expression of Bax gene， the ability to induce the apoptosis is stronger.

Key words： propranolol； hemangioma； apoptosis； Bax； BAM7； siRNA

血管瘤是嬰幼兒最常見的血管源性良性腫瘤[1]，新生兒的患病率約為2%～3%，1歲以內(nèi)血管瘤患病率達(dá)10%[2]。血管瘤可存在于身體的任何部位，但是主要發(fā)生在頭頸部區(qū)域（60%）[3]，其次是軀干（25%）和四肢（15%）。血管瘤在患兒剛出生時通常很難被察覺，常伴隨明顯的生物學(xué)行為：在患兒出生1周后進(jìn)入迅速生長階段；在患兒3～6月期間持續(xù)增殖；穩(wěn)定幾個月后，于患兒1歲以后進(jìn)入自發(fā)消退階段，此消退過程通常持續(xù)5～7年[4]。目前關(guān)于血管瘤的消退機(jī)制更傾向于是由細(xì)胞凋亡引起的。研究發(fā)現(xiàn)消退期的嬰幼兒血管瘤的凋亡率是增殖期的5倍，而且凋亡的主要是血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（Hemangioma endothelia cell， HemEC）[5]。消退期嬰幼兒血管瘤組織中，F(xiàn)as、Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)基因呈高表達(dá)，而凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)則相對較低[6]。本課題研究Bax的表達(dá)量與普萘洛爾誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為明確血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡途徑奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和檢測儀器：鹽酸普萘洛爾粉劑（武漢欣欣佳麗生物科技有限公司）、SABC免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）、AnnexinV-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）、BAM7（美國Med Chem Express公司）；Real Time PCR儀（美國Bio-Rad公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix（日本TaKaRa公司）；Trizol Reagent（美國ambion公司）；SYBR Premix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）；DNA Transfection Reogent（美國Polyplus公司）；siRNA合成（上海吉瑪制藥有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞來源于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院小兒外科惠贈的人增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，一般選擇細(xì)胞性狀相對穩(wěn)定的第5～6代細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)，并用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原的表達(dá)。

1.3 不同濃度普萘洛爾溶液干預(yù)：細(xì)胞分組：空白對照組： 0μmol/L；實(shí)驗(yàn)組：100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L。取處于對數(shù)生長期的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，接種于12孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入不同濃度的普萘洛爾溶液（100、200、300、400umol/L，24h），倒置顯微鏡下連續(xù)動態(tài)觀察24h，分別記錄（0h、6h、12h、18h、24h）細(xì)胞的形態(tài)變化。同時用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。篩選出本次實(shí)驗(yàn)所用的藥物濃度和作用時間。

1.4 Bax高表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建：取對數(shù)期的細(xì)胞鋪6孔板后培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，分別加入Bax激活劑BAM7，其濃度依次為1μmol/L、1.65μmol/L、3.75μmol/L、5μmol/L、7.5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L。分別處理1h、3h、6h、12h，換液，加入普萘洛爾溶液，篩選出有意義的BAM7濃度及預(yù)處理時間組。

1.5 Bax低表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建：利用NCBI數(shù)據(jù)庫獲取人Bax mRNA的序列全長（NM_001291428）結(jié)合Roche公司提供的RNAi軟件設(shè)計和文獻(xiàn)報道，確定Bax siRNA和陰性對照siRNA（合成的siRNA序列模板見表1），應(yīng)用blast軟件在人類基因組中進(jìn)行比對以保證和其他基因沒有同源性，由上海吉瑪基因化學(xué)合成。

表1 Bax siRNA模板序列

siRNA Sequence

Bax siRNA-1（sense） 5-GGUGCCGGAACUGAUCAGATT-3

Bax siRNA-1（antisense） 3-TTCCACGGCCUUGACUAGUCU-5

Bax siRNA-2（sense） 5-AACUGAUCAGAACCAUCAUGG-3

Bax siRNA-2（antisense） 3-UUGACUAGUCUUGGUAGUACC-5

Bax siRNA-3（sense） 5-CCAUCAUGGGCUGGACAUUTT-3

Bax siRNA-3（antisense） 3-TTGGUAGUACCCGACCUGUAA-5

N.C siRNA-RL（sense） 5-GCGACGAUCUGCCUAAGAUTT-3

N.C siRNA-RL（antisense） 3-TTCGCUGCUAGACGGAUUCUA-5

取對數(shù)生長期的HemEC接種于12孔板中，培養(yǎng)約24h，加入siRNA-jetPRIME復(fù)合物，然后置于培養(yǎng)箱中生長，培養(yǎng)24～72h。實(shí)驗(yàn)組分為siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3三組，對照組分為空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 qRT-PCR檢測Bax高表達(dá)及低表達(dá)時HemEC模型的構(gòu)建：6孔板培養(yǎng)HemEC，加入1ml Trizol試劑裂解；加入200μl氯仿，冰上放置5min，4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心15min，吸取上層水相至另一Ep管中，加入500μl異丙醇，4℃，12 000轉(zhuǎn)/min離心10min；棄去上清液，75%乙醇懸浮沉淀，4℃，7 500轉(zhuǎn)/min離心5min；棄去上清，室溫晾干，加入DEPC水溶解沉淀。NanoDrop 1 000分光光度計（Nucleic Acids）檢測所提取的mRNA的濃度與純度，即A260/A280值及RNA濃度。按照TaKaRa公司說明書進(jìn)一步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和Real Time PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，每個樣本設(shè)3個平行復(fù)孔，并重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。2-△△CT表示Real Time PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)的相對變化。

1.7 Bax高表達(dá)時HemEC凋亡率的檢測：①實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組、普萘洛爾組、DMSO+普萘洛爾組、BAM7組、BAM7+普萘洛爾組；②依據(jù)所購上海七海生物公司AnnexinV-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作；③實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性：每組樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，并重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.8 Bax低表達(dá)時HemEC凋亡率的檢測：①實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為5組：空白對照組、普萘洛爾組、轉(zhuǎn)染試劑+普萘洛爾組、N.C siRNA+普萘洛爾組、Bax低表達(dá)組（siRNA+普萘洛爾組）；②加入普萘洛爾：a.siRNA轉(zhuǎn)染后24h，換液后加入普萘洛爾；b.調(diào)整藥物濃度為300μmol/L，藥物作用24h后取樣待檢；c.依據(jù)所購上海七海生物公司AnnexinV-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作；③實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性：每組樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，并重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞鑒定：血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶生長良好，采用倒置相差顯微鏡觀察可見：細(xì)胞單層貼壁生長，多角形或卵圓形，排列緊張時鑲嵌排列，似“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，有接觸抑制現(xiàn)象，高倍鏡下可見細(xì)胞偽足充分伸展，界限清晰。見圖1。

凋亡率的結(jié)果提示：BAM7+普萘洛爾組>DMSO+普萘洛爾組>普萘洛爾組>BAM7組>空白對照組，說明DMSO本身能對細(xì)胞造成一定的損害，由于BAM7是由DMSO配制的，為排除DMSO對細(xì)胞的影響，設(shè)置了DMSO+普萘洛爾組，發(fā)現(xiàn)其與普萘洛爾組的凋亡率無明顯差異；BAM7組與空白對照組無差異說明Bax水平本身上調(diào)并不會引起細(xì)胞凋亡，只有當(dāng)BAM7與普萘洛爾同時作用時才能誘導(dǎo)HemEC凋亡率上升，與普萘洛爾組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.6 Bax低表達(dá)細(xì)胞模型的建立：將N.C siRNA、Bax siRNA01、Bax siRNA02、Bax siRNA03（antisense）轉(zhuǎn)染HemEC，Real-time PCR篩選出能最大程度沉默Bax基因的siRNA，結(jié)果如圖6所示，故本實(shí)驗(yàn)選擇Bax siRNA01轉(zhuǎn)染細(xì)胞來構(gòu)建Bax的低表達(dá)模型。

2.7 Bax低表達(dá)時HemEC凋亡率檢測：用流式細(xì)胞儀檢測Bax低表達(dá)情況下普萘洛爾對HemEC凋亡的影響。凋亡率結(jié)果，Bax siRNA+普萘洛爾組>N.C siRNA+普萘洛爾組>轉(zhuǎn)染試劑+普萘洛爾組>普萘洛爾組>空白對照組，說明轉(zhuǎn)染試劑本身有一定的細(xì)胞毒性，在siRNA誘導(dǎo)Bax基因低表達(dá)時，細(xì)胞凋亡率無明顯差異。見圖7。

3 討論

嬰幼兒血管瘤增殖期，HemEC處于分裂活躍階段，嬰幼兒血管瘤消退期，HemEC則表現(xiàn)為凋亡狀態(tài)，HemEC增殖與凋亡的病理失衡狀態(tài)，才是嬰幼兒血管瘤生物學(xué)行為的本質(zhì)所在，因而許多學(xué)者認(rèn)為嬰幼兒血管瘤的自然消退與HemEC的凋亡密切相關(guān)[2，4，7]，并且有研究證實(shí)普萘洛爾可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HemEC的凋亡或抑制其增殖[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)中的HemEC來源于增殖期嬰幼兒血管瘤組織，體外培養(yǎng)可見細(xì)胞處于分裂增生活躍狀態(tài)，細(xì)胞自發(fā)凋亡少。加入不同濃度的普萘洛爾藥物后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)普萘洛爾濃度低于400?mol/L時，細(xì)胞收縮、變圓，細(xì)胞界限模糊、間隙增大，細(xì)胞脫壁、游離，但細(xì)胞膜仍保持完整，這些現(xiàn)象均符合細(xì)胞凋亡的特性。由此筆者可以得出普萘洛爾誘導(dǎo)嬰幼兒血管瘤消退可能與HemEC的凋亡有關(guān)。

Bax是Bcl-2基因家族中的重要調(diào)節(jié)者，Bid、Bim可作為活化劑，直接激活Bax，觸發(fā)Cytc的釋放；Bad、Nova等與抗凋亡蛋白競爭性結(jié)合替換出Bid、Bim等間接激活Bax[11]。它能與凋亡抑制基因Bcl-2等結(jié)合形成異二聚體，從而中和它們的作用，Bax自身可形成同二聚體Bax/Bax，正常細(xì)胞中，Bax是以非激活單體形式存在，凋亡信號被激活后，Bax構(gòu)象發(fā)生改變，激活Bax蛋白[12]，發(fā)出線粒體定位信號從而聚集到線粒體上，進(jìn)而介導(dǎo)線粒體凋亡，因而Bax易位到線粒體上是線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵。

研究[13]表明用免疫組化法染色的嬰幼兒血管瘤組織中Bax和Bcl-2均有表達(dá)，在嬰幼兒血管瘤增殖期Bcl-2表達(dá)升高，Bcl-2/Bax結(jié)合增多， 抑制細(xì)胞凋亡， 消退期中Bax表達(dá)上調(diào)， Bax/Bax結(jié)合增多， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡， 這些研究結(jié)果提示Bax與Bcl-2比率的變化可能導(dǎo)致嬰幼兒血管瘤從增殖期進(jìn)入消退期[14]。研究[15]表明口服普萘洛爾治療后的嬰幼兒血管瘤組織較普萘洛爾治療前的嬰幼兒血管瘤組織中的Bax、Caspase-9基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平上升，Bcl-2表達(dá)水平下降。

前期實(shí)驗(yàn)中研究團(tuán)隊檢測到了Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平在普萘洛爾誘導(dǎo)后的HemEC中表達(dá)上調(diào)，體外研究也證實(shí)了消退期的血管瘤組織中有Bax的高表達(dá)。BAM7是由Gavathiotis[16]提出的一種小分子化合物，有BH3結(jié)構(gòu)域凹槽能直接特異性的激活Bax，參與Bax的觸發(fā)位點(diǎn)，促進(jìn)Bax的寡聚化，有效激活Bax線粒體轉(zhuǎn)位的發(fā)生，能以Bax依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。據(jù)文獻(xiàn)報道在成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、Hela細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞中特異性激活Bax進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-19]。本實(shí)驗(yàn)在以往報道的基礎(chǔ)上，設(shè)置濃度梯度和時間梯度實(shí)驗(yàn)，篩選出最佳作用濃度和時間，即5μmol/L的BAM7預(yù)處理1h可以明顯上調(diào)Bax。研究還通過siRNA技術(shù)[20]沉默Bax基因后轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，qRT-PCR顯示Bax明顯受到抑制。

通過實(shí)驗(yàn)研究，Bax基因高表達(dá)時，普萘洛爾誘導(dǎo)的HemEC凋亡率明顯上升，這說明Bax參與了普萘洛爾誘導(dǎo)的HemEC凋亡。但當(dāng)Bax基因沉默后，細(xì)胞凋亡率并未明顯下降。這一方面提示Bcl-2家族蛋白種類繁多，且蛋白之間存在協(xié)同作用，當(dāng)Bax表達(dá)下降時，Bcl-Xs等可以繼續(xù)與Bcl-2形成異源二聚體，或者Bak可以將Bcl-2/Bax二聚體中的Bax置換出來，使Bax游離出來形成同源二聚體等，因而細(xì)胞凋亡并未受到明顯抑制；另一方面也提示普萘洛爾誘導(dǎo)HemEC的凋亡并非只有p53/Bax這一線粒體信號傳導(dǎo)途徑，還可能通過膜受體等其它途徑介導(dǎo)HemEC發(fā)生凋亡。

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[收稿日期]2018-10-12 [修回日期]2018-11-19

編輯/賈敏

本文引用格式：姚天華，Krishna Regmi，杜婧婷，等.Bax在普萘洛爾誘導(dǎo)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（1）：100-104.