地里夏提·庫爾班　陳召

[摘要]目的：分析Notch1在黑素瘤發(fā)展過程中的作用和機制。方法：采用RT-PCR檢測Notch1 mRNA在黑素瘤和正常黑素細胞中的表達，采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Notch1過表達的黑色素瘤細胞系，CCK法檢測細胞增殖能力，Transwell檢測細胞侵襲能力，劃線法檢測細胞遷移能力，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡能力，Western blot檢測細胞Notch1過表達對PI3K/AKT信號通路中AKT磷酸化水平的影響。結(jié)果：黑素瘤細胞系MM200、Mel-CV、A2058和A375細胞中Notch1 mRNA水平明顯高于正常黑素細胞系HemN-MP（P<0.05）。黑素瘤細胞A2058細胞中Notch1水平升高后，細胞的增殖速率顯著提高，在48h、72h和96h轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯高于對照組（P<0.05）；Transwell結(jié)果顯示Notch1水平升高可以顯著增加穿過小室膜A2058細胞數(shù)量（P<0.05）；劃線法結(jié)果顯示24h轉(zhuǎn)染組細胞遷移率明顯高于對照組（P<0.05）；流式細胞檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細胞早期凋亡率明顯低于對照組（P<0.05）。Notch1水平增加后，AKT蛋白磷酸化水平明顯提高，說明Notch1能夠促進PI3K/AKT信號通路的激活。加入了Notch信號通路特異性阻斷劑DAPT后，能夠有效抑制Notch1過表達引起的AKT蛋白磷酸化的升高。結(jié)論：Notch1能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路通過促進黑素瘤的發(fā)展，本研究為臨床治療黑素瘤提供了新的思路。

[關(guān)鍵詞]黑素瘤；Notch1；增殖；侵襲；凋亡；遷移；信號通路

[中圖分類號]R329.2 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2019）01-0093-04

Notch1 Regulating PI3K/AKT Signaling Pathway Promoting the Development of Melanoma Cells

Dilixiati·KUERBAN，CHEN Zhao

（Department of Burn Injury，Xinjiang Uiger Municipal People's Hospital，Urumqi 830001，Xinjiang，China）

Abstract： Objective To analyze the role and mechanism of Notch1 in the development of melanoma. Methods Notch1 mRNA expression in normal melanocytes and melanoma was detected by RT-PCR. Slow virus transfection technique was used to construct Notch1 expression of melanoma cell lines. Using CCK method to detect cell proliferation ability， Transwell to detect cell invasion ability， marking method to detect cell migration ability， flow cytometry to detect cell apoptosis， Western blot to detect cell Notch1 over expression of PI3K/AKT signal pathway of AKT phosphorylation level. Results The expression levels of Notch1 mRNA in melanoma cell lines MM200， Mel-CV， A2058 and A375 were significantly higher than that in normal melanocyte lines HemN-MP （P<0.05）. When the level of Notch1 in the melanoma cell A2058 cells was increased， the cell proliferation rate was significantly increased， and the proliferation capacity of the transfection group at 48h， 72h and 96h was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. Transwell results showed that increased Notch1 level significantly increased the number of A2058 cells passing through the compartment （P<0.05）. The results showed that the cell migration rate in the 24h transfection group was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. Flow cytometry test showed that the early apoptosis rate in transfection group was significantly lower than that in control group （P<0.05）. After the increase of Notch1 level， AKT protein phosphorylation level was significantly increased，suggesting that Notch1 could promote the activation of PI3K/AKT signaling pathway.The addition of Notch signaling pathway specific blocking agent DAPT can effectively inhibit the increase of AKT protein phosphorylation caused by Notch1 overexpression. Conclusion Notch1 can regulate PI3K/AKT signaling pathway by promoting the development of melanoma， which provides a new idea for clinical treatment of melanoma.

Key words： melanoma； Notch1； proliferation； attacks； apoptosis； migration； signal pathway

黑素瘤是一種常見的惡性皮膚腫瘤，也是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，其年增長率在3%～5%，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。研究報道[1]稱8%～46%的黑素瘤患者易出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，50%～80%晚期黑素瘤患者可出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，其死亡率居皮膚惡性腫瘤的第一位，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者中位生存時間僅為8～9個月，5年生存率低于5%，嚴重威脅人們健康。隨著靶向藥物的出現(xiàn)，患者的生存期在一定程度上能夠延長，但效果有限。文獻報道[2-3]稱Notch信號通路能夠調(diào)節(jié)細胞的生長和分化，也有研究報道稱其在乳腺癌和結(jié)腸癌中會出現(xiàn)異?；罨?，PI3K/AKT信號通路作為經(jīng)典的信號通路，在腫瘤發(fā)展過程中起著重要作用[4-5]。相關(guān)文獻[7]稱黑素瘤細胞與正常皮膚細胞相比，會分泌大量新蛋白，促進葡萄糖代謝，進而促進細胞增殖和侵襲，因此研究Notch1蛋白在黑素瘤中的功能以及分子機制將有助于臨床開發(fā)新的靶向藥物。本研究主要觀察Notch1蛋白在黑素瘤細胞增殖、侵襲、遷移以及凋亡過程中的作用，以探討其在調(diào)控黑素瘤細胞生物學(xué)特性過程中的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞及主要抗體、試劑：黑素瘤細胞系（MM200、Mel-CV、A2058和A375）和黑素細胞系HemN-MP采購自中科院上海細胞研究所；兔抗Notch1、AKT和p-AKT單克隆抗體購自美國Abcam公司；Notch通路特異性阻斷劑2，4-二氨基-5-苯噻唑（DAPT）購于Peprotech公司；酶標(biāo)儀和流式細胞儀均采購自Bio-Rad公司。所有細胞均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒細胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1d，將293T細胞接種于2個6cm培養(yǎng)皿中，細胞數(shù)為5×103個；24h后將pIRSE2-EGFP-Puro MTA1以及pIRSE2-EGFP-Puro空載對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入293T慢病毒包裝細胞；12h后更換新鮮細胞培養(yǎng)基，48h后收集病毒上清，用0.45?m孔徑過濾器過濾后，-70℃分裝、儲存。將生長良好的細胞消化計數(shù)后，以細胞密度為2.5×103個/孔接種到6孔板中，置于37℃、5% CO2及完全濕度的培養(yǎng)箱中。待細胞融合度達到80%～90%時進行轉(zhuǎn)染，將2種病毒分別轉(zhuǎn)染到細胞中，48h后消化離心重懸細胞，然后加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)篩選，從而獲得穩(wěn)定過表達Notch1的細胞系。

1.2.2 RT-PCR檢測Notch1 mRNA：細胞經(jīng)過培養(yǎng)或處理后，按照Trizol說明書提取細胞內(nèi)的總RNA，然后通過一步法轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green進行熒光定量PCR，采用Ct分析數(shù)據(jù)，內(nèi)參采用GAPDH，每個標(biāo)本做3個復(fù)空。Notch1：上游引物：5-GTGACTGCTCCCTCAACTTCAAT-3，下游引物：5-CTGTCACAGTGGCCGTCACT-3；GAPDH：上游引物：5-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3，下游引物：5-TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC-3。

1.2.3 Western blot檢測Notch1、AKT和p-AKT：細胞經(jīng)過培養(yǎng)或處理后加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，取50?g進行電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2h，加入一抗、二抗（孵育，ECL顯影后掃描，蛋白相對表達量經(jīng)內(nèi)參校正后使用Quanity-One軟件進行分析，GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4 CCK8法檢測細胞增殖能力：取傳代一致的細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103接種于96孔板中，每孔100?l，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2d更換1次培養(yǎng)基。在培養(yǎng)4h、24h、48h、72h和96h時，加入10?l的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，檢測450nm的OD值。

1.2.5 劃痕法檢測細胞遷移能力：取傳代一致的細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103接種于6孔板，采用10?l的微量加樣槍頭畫出無細胞區(qū)，采用磷酸緩沖液吸取劃痕后脫落的細胞并進行拍照。培養(yǎng)24h后拍照，觀察細胞遷移能力。遷移率=（0h劃痕距離-24h劃痕距離）/0h劃痕距離×100%。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲能力：分別采用未鋪和鋪有Matrigel膠的Transwell小室用于細胞遷移實驗，用培養(yǎng)基重懸細胞，饑餓24h，然后調(diào)整細胞濃度為1×103/ml，將100?l細胞懸液接種于Transwell小室的上室內(nèi)。在24孔板中加入400?l培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放入24孔板中，在細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育24h，取出Transwell小室用0.01M的PBS輕柔沖洗，再用棉簽輕柔擦除上室內(nèi)粘附的細胞，在95%的乙醇中固定。最后采用結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下，隨機選擇5個視野（200×），觀察穿透小室的細胞數(shù)量。

1.2.7 流式細胞檢測細胞凋亡能力：細胞轉(zhuǎn)染48h后，采用預(yù)冷的PBS洗滌細胞，加入300?l的緩沖液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，取100ul置于流式管中，分別加入5?l的Annexin V-FITC和5?l的PI，混勻室溫孕育15min，加入400?l PBS，上機檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0，繪圖采用Graphpad Prism5.0，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑素瘤細胞系和黑素細胞系中Notch1 mRNA水平：黑素瘤細胞系：MM200、Mel-CV、A2058和A375細胞中Notch1 mRNA水平明顯高于正常黑素細胞系HemN-MP（P<0.05），提示Notch1可能與黑素細胞病變?yōu)楹谒亓黾毎芮邢嚓P(guān)，并有可能參與了黑素瘤細胞的增殖和侵襲等生物學(xué)行為。見圖1。

2.2 穩(wěn)定過表達Notch1黑素瘤細胞系A(chǔ)2058構(gòu)建：轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)染組中Notch1蛋白水平和Notch1 mRNA水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示成功構(gòu)建了Notch1過表達的細胞株。見圖2。

2.3 過表達Notch1促進黑素瘤細胞A2058增殖、侵襲和遷移，抑制細胞凋亡：CCK8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示，黑素瘤細胞A2058細胞中Notch1水平升高后，細胞的增殖速率顯著提高（見圖3A），在48h、72h和96h轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示Notch1表達能夠促進黑素瘤細胞增殖。Transwell結(jié)果顯示Notch1水平升高可以顯著增加穿過小室膜A2058細胞數(shù)量（見圖3B），提示Notch1表達能夠促進黑素瘤細胞侵襲。劃線法結(jié)果顯示24h，轉(zhuǎn)染組細胞遷移率明顯高于對照組（P<0.05）（見圖3C），提示Notch1表達能夠促進黑素瘤細胞遷移。流式細胞檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細胞早期凋亡率明顯低于對照組（P<0.05）（見圖3D），提示Notch1表達能夠抑制黑素瘤細胞早期凋亡。

2.4 過表達Notch1對PI3K/AKT信號通路中AKT和p-AKT水平的影響：Notch1水平增加后，AKT蛋白磷酸化水平明顯提高（見圖4），說明Notch1能夠促進PI3K/AKT信號通路的激活。加入了Notch信號通路特異性阻斷劑DAPT后，能夠有效抑制Notch1過表達引起的AKT蛋白磷酸化的升高，提示Notch1通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路從而促進黑素瘤細胞發(fā)展。

3 討論

黑素瘤其惡性程度極高，因其發(fā)病隱匿且易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此治療棘手[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]Notch信號通路不僅決定了細胞分化方向，而且在細胞增殖、遷移以及凋亡過程中起著極其重要的作用。Notch1是Notch通路中的四個受體之一，在不同的腫瘤組織中，Notch1蛋白異?；罨瘜毎x、血管生成等起著不同的作用，從而表現(xiàn)出促進或抑制腫瘤的作用。

有文獻報道稱[11]Notch1參與了黑素細胞的惡變。本研究采用RT-PCR檢測Notch1 mRNA在黑素瘤細胞和正常黑素細胞中的表達，結(jié)果顯示黑素瘤細胞系：MM200、Mel-CV、A2058和A375細胞中Notch1 mRNA水平明顯高于正常黑素細胞系HemN-MP（P<0.05），研究結(jié)果與國外學(xué)者Golan T結(jié)果一致，提示Notch1可能與黑素細胞病變?yōu)楹谒亓黾毎芮邢嚓P(guān)，并有可能參與了黑素瘤細胞的增殖和侵襲等生物學(xué)行為。為了進一步觀察Notch1表達對黑素瘤細胞發(fā)展過程中的作用，本研究采取慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建Notch1過表達的黑素瘤細胞系，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組中Notch1蛋白水平和Notch1mRNA水平均明顯高于對照組（P<0.05），提示成功構(gòu)建了Notch1過表達的細胞株。且黑素瘤細胞A2058細胞中Notch1水平升高后，細胞的增值速率顯著提高，在48h、72h和96h轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力明顯高于對照組（P<0.05），提示Notch1表達能夠促進黑素瘤細胞增殖。Transwell結(jié)果顯示Notch1水平升高可以顯著增加穿過小室膜A2058細胞數(shù)量，提示Notch1表達能夠促進黑素瘤細胞侵襲。劃線法結(jié)果顯示24h，轉(zhuǎn)染組細胞遷移率明顯高于對照組（P<0.05），提示Notch1表達能夠促進黑素瘤細胞遷移。流式細胞檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細胞早期凋亡率明顯低于對照組（P<0.05），提示Notch1表達能夠抑制黑素瘤細胞早期凋亡。南方醫(yī)科大學(xué)齊艷霞等[13]采用小分子RNA干擾技術(shù)沉默Notch1的表達，轉(zhuǎn)染于小鼠皮下腫瘤中，結(jié)果顯示沉默Notch1能夠明顯抑制小鼠腫瘤生長，與本研究結(jié)果一致。

PI3K/AKT信號通路是目前研究最為火熱的信號通路，其能夠通過增加葡萄糖代謝，從而達到促進腫瘤細胞增殖的目的，文獻報道稱[14]在人類腫瘤組織中PI3K/AKT信號通路均處于激活狀態(tài)。還有文獻稱[6]Notch1在胸腺細胞成熟過程中能夠維持AKT的活性，本研究結(jié)果顯示Notch1表達水平上調(diào)，能夠顯著促進AKT的磷酸化，加入Notch特異性阻斷劑DAPT后能夠有效抑制Notch1過表達引起的AKT蛋白磷酸化的升高，提示Notch1通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路從而促進黑素瘤細胞發(fā)展。

盡管一些生物靶向治療在一定程度上能夠延長生存時間，但是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的黑素瘤尚缺乏有效的治療手段，本研究證實了Notch1能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路促進黑素瘤的發(fā)展，越來越多文獻[15-16]證實Notch異常活化在腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用，譬如成神經(jīng)管細胞瘤和乳腺癌，可經(jīng)Notch通過阻斷劑進行治療。本研究為臨床治療黑素瘤提供了新的思路。

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[收稿日期]2018-08-29 [修回日期]2018-10-19

編輯/賈敏

本文引用格式：地里夏提·庫爾班，陳召.Notch1調(diào)控PI3K/AKT信號通路促進黑素瘤細胞發(fā)展的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（1）：93-96.