王 杜 孫君軍 劉偉峰 楊延輝 褚智杰 楊 成 楊天保 桂 洋

急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)是種起病急、病情變化快，病因復(fù)雜、病死率高的臨床常見急危重癥，其對生命的威脅，不僅在疾病本身，更在于ANP時炎性因子激活后的炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，波及全身而引起嚴(yán)重并發(fā)癥，其中以急性肺損傷(acute lung injury，ALI)為最常見的早期并發(fā)癥[1,2]。有關(guān)ANP及其并發(fā)癥治療的研究多從體液調(diào)節(jié)的角度出發(fā)，2000年有研究人員提出膽堿能抗炎通路的新概念，強調(diào)神經(jīng)系統(tǒng)在抗炎過程中的重要作用，這為ANP抗炎治療提供了新思路[3, 4]。本研究通過檢測實驗動物模型血清P、E選擇素等生化指標(biāo)變化，結(jié)合肺組織病理，探索內(nèi)臟大神經(jīng)在ANP急性肺損傷時的保護作用。

材料與方法

1.實驗動物與試劑：健康雄性(1～2周歲)雜種犬24只，體重10～15kg，購于河南科技大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(豫)2016-0010，對實驗動物的處理經(jīng)河南科技大學(xué)動物倫理學(xué)委員會討論通過。按照隨機數(shù)字表法將犬分為假手術(shù)組(SO組)8只；急性壞死性胰腺炎模型組(ANP組)8只，實驗途中死亡2只；ANP+內(nèi)臟大神經(jīng)切斷組(GSNT組)8只。實驗途中死亡犬放棄數(shù)據(jù)統(tǒng)計。牛磺膽酸鈉及胰蛋白酶購于美國Sigma公司，P-selectin、E-selectinELISA試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司。

2.術(shù)前準(zhǔn)備：備皮，剃去腹部及前后肢毛發(fā)；測量體重。術(shù)前禁食12小時，自由飲水。實驗前1h配置牛磺膽酸鈉和胰蛋白酶混合制劑。

3.模型制作：術(shù)前15min肌注硫酸阿托品(0.1mg/kg)，舒泰50(15mg/kg)肌注誘導(dǎo)麻醉。犬麻醉成功后取仰臥位固定于動物實驗手術(shù)臺，前肢置入靜脈留置針1枚，丙泊酚[15mg/(kg·h)]泵入以術(shù)中維持麻醉狀態(tài)。腹部常規(guī)消毒鋪巾，取腹部正中切口，逐層進入腹腔，無菌濕紗布保護切口，GSNT組暴露雙側(cè)腎上腺并細(xì)心解剖分離腎上腺后上方內(nèi)臟大神經(jīng)，掛線標(biāo)記以備用，SO組、ANP組免去掛線步驟。隨后各組均在距幽門10～12cm處十二指腸前外側(cè)壁做2cm縱行切口，充分顯露可于腸腔內(nèi)后壁黏膜面見一直徑1.0～1.5mm白色臍樣凹陷，即為副乳頭(主胰管開口處)，沿此置入硬膜外麻醉導(dǎo)管(1.0mm)，進深5cm左右。固定硬膜外導(dǎo)管后，ANP、GSNT組經(jīng)微量泵向主胰管內(nèi)以7.6kPa恒定壓力注入5%?；悄懰徕c(0.5ml/kg)和胰蛋白酶(3000U/kg)混合制劑誘導(dǎo)ANP，注射完畢后，觀察5min，見胰腺組織出現(xiàn)點狀或片狀出血、壞死，提示模型初步建立；SO組經(jīng)微量泵以相同壓力及泵速注入等量生理鹽水。拔除導(dǎo)管仔細(xì)橫行縫合腸壁切口。GSNT組再次觀察5min，提起掛線剪斷雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)。最后逐層關(guān)閉腹部切口，消毒包扎。術(shù)中均以動物實驗用心電信號采集系統(tǒng)進行心電監(jiān)護。

4.術(shù)后維護支持及管理：全部動物制模完成后，禁食、禁飲。放置于清潔循環(huán)良好標(biāo)準(zhǔn)動物實驗室內(nèi)，專人陪護，觀察犬生命體征變化及手術(shù)切口。經(jīng)留置針完全腸外營養(yǎng)支持，按非蛋白熱量50kcal/(kg·d)和含氮量0.3g/(kg·d)，總補液量為60ml/(kg·d)比例補液，并補足每天體液丟失量。觀察并記錄動物心率、呼吸等生命體征，記錄24h尿量、大便次數(shù)及性狀，惡心、嘔吐情況，以及精神狀況。

5.標(biāo)本采集與檢測方法：分別于術(shù)前2h、術(shù)后12h、24h、3天、5天、7天采集外周靜脈血3ml，1ml用于淀粉酶、白蛋白(試劑盒由河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院檢驗科提供)測定；2ml血液肝素抗凝，高速離心后取上清液置于EP管中，-80℃冰箱保存，用ELISA試劑盒和酶標(biāo)儀測定A值后計算血清P-selectin、E-selectin水平。術(shù)后第7天統(tǒng)一處死實驗犬，取胰腺、肺組織標(biāo)本行病檢及病理學(xué)評分。胰腺病理學(xué)評分以改良Schmidt為評價標(biāo)準(zhǔn)，觀察組織水腫、壞死、出血、炎癥對胰腺損傷進行病理學(xué)計分[5, 6]。參照 Hofbauer等[7]方法，觀察肺組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤和出血對肺損傷進行病理學(xué)計分。

結(jié) 果

1.術(shù)前2h各組檢測結(jié)果比較：術(shù)前2h 3組AMY、ALB、P-selectin及E-selectin血清濃度檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，各組間具有可比性(表1)。

表1 術(shù)前2h 3組血清淀粉酶、白蛋白、P選擇素、E選擇素檢測

2.術(shù)后各時間點3組血清AMY水平比較：ANP組、GSNT組血清AMY水平與SO組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ANP組與GSNT組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.121)；ANP組與GSNT組AMY水平于術(shù)后第1天出現(xiàn)峰值，隨后檢測呈下降趨勢；SO組AMY水平無明顯波動(表2)。

表2 術(shù)后各時間點3組血清AMY檢測

3.術(shù)后各時間點3組血清ALB水平比較：ANP組、GSNT組血清ALB水平與SO組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ANP組與GSNT組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ANP組、GSNT組術(shù)后血清ALB水平均呈下降趨勢(表3)。

表3 術(shù)后各時間點3組血清ALB檢測

4.術(shù)后各時間點3組血清 E-selectin水平比較：ANP組、GSNT組血清E-selectin水平與SO組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ANP組血清E-selectin水平較GSNT組升高明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

表4 術(shù)后各時間點3組血清E-selectin檢測

5.術(shù)后各時間點3組血清P-selectin水平比較：ANP組、GSNT組血清P-selectin水平與SO組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ANP組血清P-selectin水平較GSNT組升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表5)。

表5 術(shù)后各時間點3組血清P-selectin檢測

6.胰腺及肺組織病理變化：(1)胰腺光鏡下病理改變：SO組胰腺組織光鏡下結(jié)構(gòu)基本正常(圖1A)；ANP組胰腺腺泡水腫，小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤，組織出血、壞死明顯(圖1B)；GSNT組散在炎性細(xì)胞浸潤，出血、壞死及小葉結(jié)構(gòu)破壞情況較ANP組輕(圖1C)。(2)肺組織光鏡觀察：SO組肺組織光鏡下無明顯病變，肺泡結(jié)構(gòu)清晰(圖2A)；ANP組光鏡下可見肺泡壁水腫增寬，間質(zhì)血管充血、出血明顯，炎性細(xì)胞浸潤(圖2B)；GSNT組肺泡壁水腫，間質(zhì)血管充血、出血，炎性細(xì)胞浸潤，病變情況較ANP組輕(圖2C)。(3)胰腺組織病理評分：SO組病理評分明顯低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ANP組評分明顯高于GSNT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。(4)肺組織病理評分：SO組病理評分明顯低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ANP組評分明顯高于GSNT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

7.實驗中途犬死亡情況：SO組、GSNT組實驗途中無犬死亡情況；ANP組實驗中途死亡兩只，立即進行尸體解剖。1只于第3天因感染性休克死亡，1只于第4天死于肺損傷所致呼吸衰竭。

圖1 各組胰腺組織光鏡下病理改變(HE,×200)

圖2 各組肺組織光鏡下病理改變(HE,×200)

圖3 3組胰腺組織病理學(xué)評分與SO組比較,*P<0.05；與ANP組比較，#P<0.05

圖4 3組肺組織病理學(xué)評分與SO組比較,*P<0.05；與ANP組比較，#P< 0.05

討 論

ANP時多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子間級聯(lián)反應(yīng)使胰腺局部炎癥進展至全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、 多臟器損傷，最終致MODS[8, 9]。肺是病理進展中最先累及的胰腺外器官，表現(xiàn)為急性肺損傷(ALI)。中性粒細(xì)胞是引起肺損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞，炎性反應(yīng)時P選擇素、E選擇素參與并啟動了中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的接觸與黏附，使中性粒細(xì)胞在肺中大量“滯留”，后者可通過釋放其他炎性介質(zhì)，激活肺血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)選擇素進而形成“級聯(lián)反應(yīng)”，加重肺組織損傷[10～12]?？梢哉f，ANP病程進展中，P選擇素、E選擇素介導(dǎo)的黏附過程對炎性反應(yīng)擴布起到了重要作用。

ANP時機體炎性反應(yīng)失控、應(yīng)激反應(yīng)，交感神經(jīng)張力高于迷走神經(jīng)。前者參與調(diào)控炎性反應(yīng)的通路主要為“下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPAA)”， HPAA是人體內(nèi)分泌系統(tǒng)重要組成部分，亦是“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)”的重要體現(xiàn)[13]。過度興奮的交感神經(jīng)可導(dǎo)致血清糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺等水平升高，進而引起淋巴細(xì)胞增殖減少、NK細(xì)胞活性下降、抗體生成水平降低等免疫改變，致機體免疫反應(yīng)降低[14]。過去的研究強調(diào)抗炎機制是通過體液途徑來實現(xiàn)的，自Borovikova等[3]在2000年首次提出 “膽堿能抗炎通路”的概念至今，更多的研究證實神經(jīng)系統(tǒng)可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)并能起到重要作用[15～17]。因此膽堿能抗炎通路的發(fā)現(xiàn)，不僅建立了神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系，更為治療ANP時失控的炎性反應(yīng)提供了一個新思路。

本研究以犬為研究對象建立ANP模型，采用離斷腹腔雙側(cè)內(nèi)臟大神經(jīng)達(dá)到減低交感神經(jīng)張力的作用，通過檢測血清P選擇素、E選擇素、淀粉酶、白蛋白水平以及胰腺、肺組織病理評分，認(rèn)識神經(jīng)系統(tǒng)對ANP時肺組織的影響。實驗發(fā)現(xiàn)術(shù)前2h各組血清AMY、ALB、P選擇素、E選擇素的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各組之間有可比性。造模后ANP組、GSNT組血清AMY、P選擇素、E選擇素濃度較SO組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，臨床工作中血清AMY升高常提示胰腺疾病，并且P選擇素、E選擇素在正常情況時低水平表達(dá)或不表達(dá)，而在急性炎癥早期中性粒細(xì)胞向受損部位趨集過程中表達(dá)明顯集中[18, 19]。因此，血清AMY、P選擇素、E選擇素水平的升高表明造模急性壞死性胰腺炎成功；術(shù)后ANP組與GSNT組各時間點AMY水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明血清AMY水平與胰腺炎嚴(yán)重程度無關(guān)。ANP組、GSNT組術(shù)后血清ALB較SO組明顯降低，且ANP組、GSNT組血清ALB水平均呈下降趨勢，考慮其降低原因主要為ANP時因炎性反應(yīng)周圍組織大量滲出，肝臟合成減少，應(yīng)激反應(yīng)分解代謝增強；血清ALB水平可作為評估ANP嚴(yán)重程度及判斷臨床預(yù)后的指標(biāo)，與ANP嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。ANP組術(shù)后各時間點血清P選擇素、E選擇素水平均明顯高于GSNT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時ANP組胰腺、肺病理評分明顯高于GSNT組，光鏡下可觀察到ANP組胰腺、肺組織損傷情況較GSNT組明顯。P選擇素、E選擇素的表達(dá)水平與細(xì)胞因子TNF-α的作用密切相關(guān)，離斷內(nèi)臟大神經(jīng)可降低ANP炎性反應(yīng)時血清TNF-α的濃度，這可能與離斷內(nèi)臟大神經(jīng)后迷走神經(jīng)相對興奮有關(guān)[20]。迷走神經(jīng)感覺纖維在炎性反應(yīng)刺激下，將炎性反應(yīng)信息經(jīng)迷走神經(jīng)傳入支傳入神經(jīng)中樞，經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)處理后，迷走神經(jīng)傳出支通過突觸的方式釋放乙酰膽堿可激活免疫細(xì)胞上膽堿能受體，降低TNF-α的濃度進而降低P選擇素、E選擇素表達(dá)水平，影響早期炎癥發(fā)生、發(fā)展中炎性細(xì)胞黏附-損傷過程；同時，激活的膽堿能抗炎通路能快速直接調(diào)節(jié)全身性炎性反應(yīng)，而起到抑制炎性反應(yīng)減輕組織損傷的作用。

本研究顯示，內(nèi)臟大神經(jīng)離斷能降低犬ANP時血清中P選擇素、E選擇素水平，減輕胰腺以及肺組織損傷程度，證實膽堿能通路在炎性性疾病中具有重要調(diào)節(jié)作用。隨著對ANP發(fā)病機制、神經(jīng)抗炎機制認(rèn)識的加深，進一步探討并找到無創(chuàng)調(diào)節(jié)交感-迷走神經(jīng)張力平衡的方法是治療ANP時肺損傷的新方向。