吳滿意
(皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院,安徽 蕪湖 241004)
近年來,我國大多數(shù)男性出現(xiàn)了許多不健康的生活方式,例如:抽煙、喝酒、長時間熬夜、不健康性行為等,造成我國男性的不育概率在近年內(nèi)有了明顯上升的趨勢[1]。對于一些因男方不育而無法正常生育但卻想要孩子的家庭來說,人工授精是最佳的方法,精子優(yōu)選是人工授精工作中一個重要的步驟,其目的在于通過分離技術(shù),選出質(zhì)量佳的精子進行人工授精,進而提高授精的成功率[2]。在優(yōu)選分離的過程中,除了通過降低分離技術(shù)對精子的傷害來提高精子質(zhì)量外,臨床研究顯示加入水溶性維生素E也可有效提高精子分離后的質(zhì)量[3]。本次研究通過對比分析的方法,對比了單一分離和加入水溶性維生素E進行分離對精子質(zhì)量的影響。
本次研究中,選取2017年6月至2018年6月在我院接受不育治療的40例男性患者的新鮮精液,將每例精液均分為4份,每份各包括40例精液,每2份為一組,共分為對照組和實驗組兩個組別?;颊吣挲g23-33歲,平均(28.30±1.50)歲,所選取的患者均與女性配偶有1年或以上的未采取避孕措施的性行為,但女方未見任何懷孕跡象,且女方經(jīng)身體檢查,未患有不孕癥。排除標準:排除近期發(fā)生身體感染、全身性疾病、腎功能衰竭、3個月內(nèi)有發(fā)熱及用藥情況、有長期不良環(huán)境暴露史、1周內(nèi)有性行為的患者。采集后的精液進行毒性測試顯示合格后,保存于安全容器內(nèi),檢測顯示患者的精液濃度均>20×106/mL,患者前向運動的精子率均>32%,患者精子的形態(tài)正常率均≥4%。
(1)對照組精子分離方法。對照組的2份精液分別通過上游法和密度梯度法進行分離,具體方法如下。
①上游法:采用Quinn’s Sperm Washing Medium 上游離心洗滌,取一只干凈試管,向其中加入1 mL精液和1.5 mL Washing培養(yǎng)液,讓試管在保持45°傾斜的情況下于37℃條件下進行1 h的孵育,另取一干凈試管,將1.2 mL的上層液體加入其中,再加入2 mL的Washing培養(yǎng)液,在200 g的條件下進行8 min的離心操作后將上清液去除,最后,將精液重懸于0.5 mL的Washing培養(yǎng)液中,在37℃的條件下進行0.5 h的孵育。
②密度梯度法:采用PureCeption密度梯度離心法,濃度分別為80%和40%,取一干凈錐底管,向其中加入1 mL密度梯度液(80%)后,在其上方緩慢滴加1 ml密度梯度液(40%),再在最上層加入1 mL精液,在300×g的條件下進行20 min的離心操作后將上清液去除,最后,將精液重懸于0.5 mL的Washing培養(yǎng)液,在37℃的條件下進行0.5 h的孵育。
(2)實驗組精子分離方法。實驗組的2組精液選取的分離方法與對照組相同,并在對照組的基礎上加入一定濃度的水溶性維生素E。具體方法如下。
①上游法:使用Quinn’s Sperm Washing Medium的Washing液,并向其中加入水溶性維生素E(濃度為30-240μmol·L-1),其余操作與對照組相同,只需將對照組中加入的Washing液更換為滴加了水溶性維生素E的Washing液即可。
②密度梯度法:采用PureCeption密度梯度離心法,濃度分別為80%和40%,其余操作與對照組相同,并各向其中加入水溶性維生素E(濃度為30-240μmol·L-1),只需將對照組中加入的Washing液更換為滴加了水溶性維生素E的Washing液即可。
通過對比兩組精子在分離后0 h和24 h的前向運動精子率、活動精子率,以及獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平,從而對分離效果進行有效評價。其中前向運動精子率、活動精子率通過計算機輔助精子分析儀進行檢測分析,精子活動指數(shù)=孵育后活動精子率/孵育前活動精子率[4];精子獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平的檢測,利用酪氨酸磷酸化抗體熒光標記物檢測精子尾部TP狀況[5]。
本次研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行分析處理,計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,將均數(shù)±標準差作為計量資料(精子活力情況、獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平)等的表示方法,t作為組間數(shù)據(jù)進行檢驗。進行比較后得出P,當P<0.05時,數(shù)據(jù)處理結(jié)果的統(tǒng)計學意義明顯。
實驗組精子在分離后0 h、24 h的前向運動精子率、活動精子率均優(yōu)于對照組(P<0.05),詳見表1。
表1 分離后0 h、24 h精子活力情況(±s)
表1 分離后0 h、24 h精子活力情況(±s)
注:*t=3.0564,*P=0.0013;#t=13.3158,#P=0。
上游法 密度梯度法實驗組 對照組 實驗組 對照組0 h前向運動精子(%) 79.69±9.26 63.75±9.82 62.76±11.45 47.99±12.89 24h h前向運動精子(%)指標組別55.88±38.06 30.01±14.73 50.93±16.08 27.74±10.57 0 h活動精子(%) 90.06±8.03 81.03±7.68 89.12±9.18 83.50±13.18 24 h活動精子(%) 77.68±41.60 46.32±17.88 66.46±17.69 42.95±14.51精子活動指數(shù) 0.85±0.54* 0.57±0.21* 0.97±0.21# 0.45±0.13#
實驗組獲能0 h和2 h后酪氨酸磷酸化水平均高于對照組(P<0.05),詳見表2。
表2 精子獲能0 h和 2h后酪氨酸磷酸化水平(±s)
表2 精子獲能0 h和 2h后酪氨酸磷酸化水平(±s)
注:*t=2.1356,*P=0.0359;#t=2.1686,#P=0.0332。
指標組別上游法 密度梯度法實驗組 對照組 實驗組 對照組獲能0 hTP(%) 6.22±7.07 5.09±6.21 9.76±9.86 7.84±8.13獲能2 hTP(%) 14.33±12.53 10.62±9.39 18.98±14.83 13.84±11.58△ TP(%) 8.10±5.66* 5.71±4.25* 9.32±8.09# 6.00±5.32#
精子優(yōu)選的目的是選出高質(zhì)量的精子,因此通過有效的手段來提高精子優(yōu)選工作的效率十分必要[6]。水溶性維生素E苯環(huán)上的酚羥基被乙?;ニ鉃榉恿u基后為生育酚。生育酚能促進性激素分泌,使男子精子活力和數(shù)量增加[7-8]。本次研究通過對比分析的方法,驗證了水溶性維生素E可在精子優(yōu)選過程中提高精子質(zhì)量這一事實。
綜上所述,在精子優(yōu)選分離的過程中,向其中加入水溶性維生素E,可以有效改善分離后的精子質(zhì)量,因此,值得推廣。