自發(fā)性糖尿病大鼠的抑郁癥行為與鈣網(wǎng)織蛋白前體、原肌球蛋白1、細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1和活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)的關(guān)聯(lián)

丁迎 馬計(jì) 方麗潔 肖娟 張競文 鄧玉潔

1武漢市武東醫(yī)院（武漢市第二精神病醫(yī)院）康復(fù)科（武漢430084）；2湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科（湖北襄陽441021）；3澳門城市大學(xué)心理分析研究院（澳門999078）

抑郁癥是一種情感性精神障礙疾病，患者的主要臨床表現(xiàn)包括持久的心境低落且思維與行為異常，患者往往出現(xiàn)抑郁、自卑、情緒低落等悲觀心境狀態(tài)，部分患者存在自殺傾向及行為，近年來，抑郁癥的發(fā)病率呈逐年攀升的趨勢。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，由于神經(jīng)退行性病變的重要病理基礎(chǔ)之一即為海馬神經(jīng)元凋亡，為此研究人員推斷海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可能與抑郁癥的發(fā)病相關(guān)［1-3］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，至少有三分之一的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)相關(guān)抑郁障礙，而抑郁癥患者發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加37%。近日，第52 屆歐洲糖尿病研究協(xié)會(huì)（EASD）年會(huì)上公布的一項(xiàng)全球研究數(shù)據(jù)顯示，中國2 型糖尿病患者抑郁癥發(fā)生率為10.8%。CUMS 是一種經(jīng)典的抑郁癥模型制作方案，該方案已經(jīng)得到了國內(nèi)外的高度認(rèn)可，此模型能夠通過對抑郁癥的環(huán)境誘因進(jìn)行模擬，從而產(chǎn)生抑郁癥的主要臨床表現(xiàn)及其引發(fā)的腦代謝變化。鈣網(wǎng)織蛋白前體（calreticulin precursor）、原肌球蛋白1（tropomyosin l）、細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1（milogen activated prolein kinase l）以及雙重特異性的活化分裂素蛋白激酶1（dual specificity mitogen-activated protein kinase l）是4 種與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的蛋白，已有研究指出上述4 種蛋白在抑郁癥大鼠海馬組織中含量顯著下調(diào)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是探討抑郁癥大鼠的抑郁行為與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白之間的相關(guān)性，以為臨床診治提供理論研究和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 本研究以20 只成年雄性健康大鼠（對照組）、40 只自發(fā)性糖尿病大鼠為研究對象，采用隨機(jī)數(shù)字法將40 例自發(fā)性糖尿病大鼠分為糖尿病組與糖尿病抑郁組，糖尿病抑郁組受試大鼠構(gòu)建抑郁模型，每只大鼠單籠喂養(yǎng)，溫度22～24℃，相對濕度60%，自然光照，保持良好通風(fēng)通風(fēng)。

1.2 研究方法

1.2.1 CUMS 法構(gòu)建抑郁大鼠模型［4］糖尿病抑郁組受試大鼠進(jìn)行下列7 種刺激：夾尾1 min、熱烘5 min、4 ℃冰水游泳5 min、水平振蕩30 min、禁水24 h、禁食24 h、晝夜顛倒。夾尾指將大鼠置于固定籠內(nèi)，將尾部露出，采用止血鉗在距尾根1 cm 處夾住并持續(xù)1 min；熱烘指將大鼠置于45 ℃恒溫水浴箱內(nèi)5 min；冰水游泳指將大鼠置于裝有約15 cm 高的4 ℃冰水桶內(nèi)5 min；振蕩指將大鼠置于160 次∕min 的告訴振蕩器內(nèi)30 min；禁水指大鼠7：00am 次日7：00am 的24 h 期間不喂水；禁食指大鼠7：00am 次日7：00am 的24 h 期間不喂食；晝夜顛倒指將大鼠于7：00a.m。置于內(nèi)面漆黑且不透光的黑暗狀態(tài)，至7：00p.m 時(shí)日光燈使其處于光照條件下直到次日7：00a.m。上述刺激每日進(jìn)行1種，且每2 種刺激不可連續(xù)出現(xiàn)，共計(jì)3 周，具體安排如下：禁水，第1、8、15、22日；熱烘，第2、9、16日；禁食，第3、10、17日；晝夜顛倒，第4、11、18日；冰水游泳，第5、12、19日；振蕩，第6、13、20日；夾尾，第7、14、21日。

1.2.2 蔗糖水消耗試驗(yàn)、曠野試驗(yàn)測定大鼠抑郁行為 （1）蔗糖水消耗試驗(yàn)：兩組受試大鼠于禁水次日，測定其1%蔗糖溶液的飲用量。（2）曠野試驗(yàn)：造模結(jié)束后對受試大鼠進(jìn)行曠野試驗(yàn)，記錄其運(yùn)動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)敞箱為長、寬、高分別為80 cm、80 cm、40 cm 的立柱體，內(nèi)空、周壁為黑色，用黑線將地面劃分成等面積（16 cm×16 cm）的25 塊。將大鼠置于中心方格內(nèi)，水平活動(dòng)得分指大鼠穿越地面方塊的數(shù)量，垂直活動(dòng)指大鼠的直立次數(shù)，每只受試大鼠僅測定1 次，每次3 min，在安靜的條件下于早7：30 至中午12：00 時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行測定。

1.2.3 受試大鼠海馬組織中蛋白表達(dá)水平測定 海馬組織的制備，采用銳利的剪刀對大鼠進(jìn)行快速斷頭，采用提前預(yù)冷（4 ℃）生理鹽水對腦組織血液進(jìn)行沖洗，將多余肌肉減掉，以十字形剪開顱底，采用血管鉗將顱骨分離后在保證腦組織完整的前提下將其取下；采用眼科鑷對海馬表面的腦組織與筋膜進(jìn)行徹底剝離；將眼科鑷凹面向上，向兩側(cè)輕輕完撐開，將海馬取下，稱重并記錄，置于凍存管中密封后保存在液氮中。采用Western法測定海馬組織中鈣網(wǎng)織蛋白前體、原肌球蛋白1、細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 以及雙重特異性的活化分裂素蛋白激酶1 4 種蛋白表達(dá)水平，兔抗大鼠鈣網(wǎng)織蛋白前體多克隆抗體、兔抗大鼠原肌球蛋白1 多克隆抗體、兔抗大鼠細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 多克隆抗體、兔抗人活化分裂素蛋白激酶1 多克隆抗體購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試大鼠應(yīng)激第1、8、15日飲用蔗糖水量比較 應(yīng)激第1、8日，3 組受試大鼠飲用蔗糖水量不存在顯著差異（P＞0.05）；應(yīng)激第15、22日，糖尿病抑郁組受試大鼠飲用蔗糖水量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對照組與糖尿病組受試大鼠飲用蔗糖水量不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖1。

圖1 3 組受試大鼠應(yīng)激第1、8、15日飲用蔗糖水量比較Fig.1 Comparison of the rats in drinking water for first，eighth，fifteenth days under stress

2.2 3組受試大鼠曠野試驗(yàn)水平、垂直得分比較 糖尿病抑郁組受試大鼠曠野試驗(yàn)水平得分、垂直得分均明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠大曠野試驗(yàn)水平得分、垂直得分不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 3組受試大鼠鈣網(wǎng)織蛋白前體表達(dá)水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠鈣網(wǎng)織蛋白前體表達(dá)量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠鈣網(wǎng)織蛋白前體表達(dá)水平不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

2.4 3組受試大鼠原肌球蛋白1表達(dá)水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠原肌球蛋白1 表達(dá)量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠原肌球蛋白1表達(dá)水平不存在顯著差異（P ＞0.05）。見圖4。

2.5 3組受試大鼠細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 表達(dá)水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 表達(dá)量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 表達(dá)水平不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖5。

2.6 3組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)水平比較 糖尿病抑郁組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)量明顯低于對照組及糖尿病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與糖尿病組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)水平不存在顯著差異（P＞0.05）。見圖6。

圖2 3 組受試大鼠曠野試驗(yàn)水平、垂直得分比較Fig.2 Comparison of field test and vertical score between the rats

圖3 受試大鼠鈣網(wǎng)織蛋白前體表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of expression levels of calreticulin precursor in the rats

圖4 受試大鼠原肌球蛋白1 表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of tropomyosin 1 expression in the rats

圖5 3 組受試大鼠細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of the expression levels of cytokinin kinase 1 in three groups of rats

3 討論

當(dāng)前的研究指出，糖尿病和抑郁癥兩者共病導(dǎo)致臨床結(jié)局變得更差。同時(shí)患有糖尿病和抑郁癥這兩種疾病的患者出現(xiàn)疾病相關(guān)并發(fā)癥的可能性，比只患其中一種疾病的患者高出2 倍。因?yàn)榱硪环N疾病的存在，導(dǎo)致兩種疾病的預(yù)后都變得更差，包括疾病的嚴(yán)重程度，治療抵抗率和病死率增加，個(gè)體和社會(huì)的治療花費(fèi)明顯上升，生存質(zhì)量和糖尿病自我管理能力下降，并發(fā)癥發(fā)生率提高，以及預(yù)期壽命減少。

圖6 3 組受試大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)水平比較Fig.6 Comparison of expression levels of activin splice kinase 1 in three groups of rats

抑郁癥是由多基因、多因素等共同導(dǎo)致的疾病，目前尚未發(fā)現(xiàn)單一的抑郁癥致病基因以及固定的遺傳模式［5-6］。近年來，隨著對抑郁癥研究的不斷深入，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抑郁癥易感基因，然而部分基因所編碼的蛋白產(chǎn)物的作用尚未明確。當(dāng)前蛋白質(zhì)組的三大研究熱點(diǎn)包括腦蛋白組、血液蛋白質(zhì)組以及肝臟蛋白質(zhì)組，上述也領(lǐng)域是國內(nèi)外研究的難點(diǎn)于薄弱環(huán)節(jié)。由于蛋白質(zhì)具有翻譯調(diào)控以及翻譯后修飾等功能，蛋白組學(xué)可對轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及基因組學(xué)的缺陷進(jìn)行有效彌補(bǔ)，相對于基因組學(xué)來說，蛋白組學(xué)能夠提供更多的信息，并可對基因功能進(jìn)行直接揭示。蛋白質(zhì)作為基因的最終編碼產(chǎn)物以及藥物的直接作用靶點(diǎn)，其相關(guān)研究對抑郁癥等多種疾病的早期診斷、治療以及預(yù)后評估方面意義重大，“抑郁蛋白”有望開啟抑郁癥治療的新思路［7-10］。

研究顯示，在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制的發(fā)生發(fā)展過程中海馬扮演著重要角色［11］。MRI 及尸檢結(jié)果均已顯示，抑郁癥患者的海馬體積相對較??；研究人員通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑郁動(dòng)物的糖皮質(zhì)激素水平上升，能夠通過使得神經(jīng)營養(yǎng)因子水平降低，最終發(fā)揮興奮性毒性作用，引起海馬神經(jīng)發(fā)生降低。此外，另有研究證實(shí)，大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生可與抗抑郁藥物治療后出現(xiàn)增加，以X 線對藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行阻斷后，動(dòng)物的抑郁行為會(huì)隨之復(fù)發(fā)。上述結(jié)論均表明，抗抑郁藥物改變抑郁行為通過對海馬的神經(jīng)發(fā)生進(jìn)行刺激以實(shí)現(xiàn)的，但目前仍尚未明確抑郁癥的致病以及抗抑郁藥物作用過程相關(guān)的蛋白包括哪些。

研究人員為健康大鼠應(yīng)用抗抑郁藥物氟西汀并對其海馬蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)用藥后大鼠神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化。鈣網(wǎng)織蛋白前體與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)，屬于生長發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白之一與蛋白合成及維護(hù)、腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲等過程相關(guān)；細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中的神經(jīng)發(fā)生及神經(jīng)分化，研究表明細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶與神經(jīng)炎癥過程中軸突運(yùn)輸以及構(gòu)建神經(jīng)微絲相關(guān)，其水平異?？赡軙?huì)造成神經(jīng)變性，研究發(fā)現(xiàn)其在家族性多發(fā)性神經(jīng)病患者體內(nèi)表達(dá)水平降低［12-14］。原肌球蛋白1 表達(dá)水平異常與非小細(xì)胞肺癌、膀胱移行細(xì)胞癌等疾病相關(guān)［15］。本研究通過構(gòu)建自發(fā)性糖尿病抑郁大鼠的UCMS 模型，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)糖尿病抑郁組受試大鼠曠野試驗(yàn)水平得分、垂直得分均明顯低于對照組及糖尿病組，提示抑郁模型構(gòu)建成功；采用ELISA 法測定上述4 種蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性糖尿病抑郁大鼠海馬組織中鈣網(wǎng)織蛋白前體、原肌球蛋白1、細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1 和活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)量均明顯低于健康大鼠及糖尿病大鼠，提示大鼠抑郁行為與上述4 種蛋白表達(dá)水平降低有關(guān)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)，可以通過神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白反映抑郁癥的發(fā)病進(jìn)展情況。本研究的不足之處是，雖然從本研究結(jié)論能夠推斷出海馬神經(jīng)發(fā)生相關(guān)蛋白含量降低于抑郁癥的發(fā)病具有一定的相關(guān)性，但仍有其他因素可能與該癥的發(fā)病相關(guān)，如例糖皮質(zhì)激素水平上升對大腦皮層、海馬以及皮層下區(qū)域產(chǎn)生直接毒性作用等［16-18］，這也是本課題組進(jìn)一步的研究方向。

綜上所述，自發(fā)性糖尿病大鼠的抑郁癥行為與大鼠海馬組織中鈣網(wǎng)織蛋白前體、原肌球蛋白1、細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶1、活化分裂素蛋白激酶1 表達(dá)水平下降相關(guān)。