體外消化對金瓜籽抗氧化肽抗氧化活性的影響

陳麗花，朱楚楚，李冉冉

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)食品科學(xué)與工程系，上海 201418）

金瓜（Cucurbita pepo L. var. medullosa Alef.）是上海崇明的傳統(tǒng)名特產(chǎn)之一，其瓜絲素有“植物海蜇”之美譽。崇明年產(chǎn)金瓜1.7萬 t左右[1]，金瓜籽近百噸，隨著金瓜絲的熱銷，金瓜及金瓜籽的產(chǎn)量也不斷增加。金瓜籽形狀飽滿、肉質(zhì)厚實，但目前僅作為炒貨加以利用。一般瓜籽中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達20%～30%，金瓜籽蛋白質(zhì)含有8 種必需氨基酸，且組成比較合理，營養(yǎng)價值較高[2]，但鮮見對其深加工的研究報道。

天然抗氧化肽具有清除重金屬和促進過氧化氫分解的作用，可降低自氧化速率，減少脂肪過氧化氫含量和自由基的生成[3]。與化學(xué)法相比，酶解法生產(chǎn)抗氧化肽具有溫和、高效、易控、安全等優(yōu)勢。國內(nèi)外研究人員已從不同來源的蛋白質(zhì)中制備出多種具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)[4]，但這些研究主要集中在肽類的高效分離制備及構(gòu)效關(guān)系的研究上[5-6]，而對活性肽在體內(nèi)生物有效性的研究卻鮮有報道。由于消化系統(tǒng)的復(fù)雜性、實驗?zāi)Ｐ碗y以建立、體內(nèi)大分子難以控制等因素影響，消化實驗難以在活體中進行。體外模擬消化既能在一定程度上真實模仿人體內(nèi)環(huán)境，同時節(jié)省了大量資源，方便且易于控制[7]。金瓜籽抗氧化肽（antioxidant peptides from golden melon seeds，APG）具有較強抗氧化活性，研究其在體內(nèi)的生物有效性是一項極具前景和應(yīng)用性的課題。目前還鮮見關(guān)于其在體外模擬胃腸道消化情況的報道，因此研究APG在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性顯得至關(guān)重要。

本研究以金瓜籽為原料，通過單因素試驗及Box-Behnken響應(yīng)面試驗優(yōu)化了酶法制備APG的工藝參數(shù)；將不同分子質(zhì)量的APG在體外模擬胃腸道消化，分別從產(chǎn)物的游離氨基酸組成、分子質(zhì)量分布及抗氧化活性變化等角度分析了抗氧化肽在胃腸道消化過程中的生物有效性變化，旨在為APG作為功能性抗氧化劑的生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金瓜籽 上海躍進食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活力200 U/mg，最適溫度55 ℃、最適pH 9.0）、酸性蛋白酶（酶活力50 U/mg，50 ℃、pH 4.0）、中性蛋白酶（酶活力100 U/mg，50 ℃、pH 7.0）、復(fù)合蛋白酶（酶活力120 U/mg，55 ℃、pH 7.0）、胃蛋白酶（酶活力3 000 U/mg，60 ℃、pH 2）、胰酶（酶活力8hUSP，40 ℃、pH 7.5） 美國Sigma公司；氫氧化鈉（分析純）國藥集團（上海）化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁儀器有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S-433D型全自動氨基酸分析儀 德國SYKAM公司；WFZ UV2350紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；MSM2013實驗用全能型膜分離裝置 上海摩速科學(xué)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金瓜籽粕的制備

將過80 目篩的金瓜籽粉與蒸餾水按1∶7（m/V）混合，調(diào)pH值至7.4，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%復(fù)合蛋白酶（以金瓜籽粉質(zhì)量計）56 ℃下酶解2 h后100 ℃滅酶10 min，4 000 r/min離心20 min，得到游離油、乳狀液、酶解液、沉淀。將乳狀液、酶解液和沉淀冷凍干燥，得到金瓜籽粕。

1.3.2 金瓜籽蛋白酶解液的制備

金瓜籽粕→加水并攪拌均勻→調(diào)pH值→酶解→滅酶（100 ℃、10 min）→冷卻后離心（4 000 r/min、20 min）→收集上清液（即APG）。

1.3.3 抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測定

將2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液（溶于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液）置于試管中，加入2 mL 1.3.2節(jié)所得樣品，振蕩混勻，室溫放置30 min后在517 nm波長處測其吸光度[8]。DPPH自由基清除率根據(jù)公式（1）計算。

式中：Ai為待測樣品的吸光度；Ac為2 mL DPPH溶液和2 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液的吸光度；Aj為2 mL樣品和2 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液的吸光度。

1.3.3.2 羥自由基清除率的測定

取樣品2 mL，加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L的H2O2，混勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸混勻，靜置30 min后于510 nm波長處測吸光度[9]。羥自由基清除率根據(jù)公式（2）計算。

式中：Ai為待測樣品的吸光度；Aj為雙蒸水代替水楊酸測得的吸光度；A0為VC代替樣品測得的吸光度。

1.3.3.3 還原力的測定

2 mL樣品加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2 mL 1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液混合液中混合，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后加入2 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸，混勻后取2 mL與2 mL蒸餾水以及0.4 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵在試管中反應(yīng)，靜置10 min后測定其在700 nm波長處的吸光度[10]，還原力與吸光度成正比。

1.3.4 APG制備的單因素試驗

以酶解產(chǎn)物的抗氧化活性為指標(biāo)，在復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶中篩選出適合金瓜籽粕酶解的最佳蛋白酶，并對底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3%、4%、5%、6%、7%）、加酶量（2%、3%、4%、5%、6%）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解pH值（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5）和酶解時間（30、60、90、120、150 min）進行單因素試驗，酶解產(chǎn)物經(jīng)離心、冷凍干燥后得到APG。

1.3.5 APG制備的Box-Behnken試驗優(yōu)化設(shè)計

在酶解產(chǎn)物抗氧化活性單因素試驗基礎(chǔ)上，選取加酶量、酶解pH值、酶解溫度和酶解時間4 個因素，根據(jù)Box-Behnken試驗原理進行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素和水平設(shè)計見表1。

表1 因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variablese used for Box-Behnken design

1.3.6 不同分子質(zhì)量APG的制備

將最佳條件下獲得的金瓜籽蛋白酶解液離心，上清液在0.25 MPa、25 ℃條件下先后用截留分子質(zhì)量為5 kDa和3 kDa的超濾膜依次超濾（圖1），得到分子質(zhì)量大于5 kDa、3～5 kDa和小于3 kDa的3 種多肽，分別在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥、備用。

圖1 不同分子質(zhì)量APG的膜分離工藝流程圖Fig.1 Flow chart of membrane separation of APG with different molecular mases

1.3.7 APG的胃腸道消化模擬

體外模擬胃腸道消化反應(yīng)參考Szo?tysik[11]和Ruiz[12]等的方法并有所改進，模擬過程分兩步反應(yīng)進行：1）模擬胃消化道的消化過程：APG粉溶于去離子水中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的溶液，調(diào)節(jié)pH值為2.0。加胃蛋白酶（APG質(zhì)量的4%），適度攪拌，置于37 ℃、100 r/min下振蕩孵育2 h，分別在0、1 h及2 h取樣，調(diào)pH值至7.5，11 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥、保藏備用。2）模擬腸消化道的消化過程：APG經(jīng)過胃消化道消化2 h后，調(diào)pH值至7.5。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%胰酶，適度攪拌，置于37 ℃、100 r/min下振蕩孵育2 h，分別在1 h及2 h取樣，100 ℃滅酶10 min，11 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍干燥、保藏備用。

1.3.8 游離氨基酸組成的測定

將400 μL樣品與100 μL體積分?jǐn)?shù)10%磺基水楊酸溶液混合，在2～8 ℃冰箱中靜置60 min后1 000 r/min離心15 min，取上清液1 000 r/min離心5 min。稀釋后經(jīng)0.45 μm尼龍濾膜過濾，用氨基酸分析儀分析。

氨基酸分析儀的工作條件[13]：色譜柱：LCA K07/Li（30 mmh4.6 mm）；進樣量20 μL；檢測波長為570 nm（脯氨酸為440 nm）；茚三酮流速為0.35 mL/min，流動相流速為0.35 mL/min；反應(yīng)器溫度為135 ℃。

1.3.9 多肽相對分子質(zhì)量分布的測定

采用凝膠滲透色譜法測定多肽的相對分子質(zhì)量分布。色譜條件：色譜柱：TSK-GEL G2000 SWXL（30 cmh7.8 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L Na2SO4＋0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）；流速：0.5 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長：220 nm[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，采用Design-Expert 8.0.5、SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA），同時進行LSD檢驗。以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 APG制備的單因素試驗

2.1.1 酶種類

圖2 酶種類對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of enzyme types on antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

圖2表明，分別經(jīng)4 種蛋白酶酶解相同時間后，堿性蛋白酶酶解金瓜籽蛋白的效果最佳，酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率分別為0.37、43.01%和62.33%。徐賢[15]選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對大豆蛋白進行酶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶作用效果最好，這與本實驗結(jié)果一致。選取堿性蛋白酶進行后續(xù)實驗。

2.1.2 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

圖3 表明，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)達到6%時，酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率與DPPH自由基清除率均達到最大值，分別為0.41、47.57%和64.19%。原因可能是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于6%時，底物與酶充分接觸發(fā)生酶解反應(yīng)而使還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率逐步升高；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于6%時，酶量不足以與全部底物發(fā)生酶解反應(yīng)，導(dǎo)致底物不能被充分酶解而降低了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。后續(xù)實驗選取底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%。

2.1.3 加酶量

圖4 加酶量對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

圖4表明，當(dāng)加酶量為3%時達到最高值，酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率分別為0.40、45.56%和58.45%。這可能是由于進一步酶解反而使具有較高還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率的多肽進一步被降解而導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抗氧化活性下降。后續(xù)實驗選取加酶量為3%。

2.1.4 酶解pH值

圖5 pH值對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of pH on antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

圖5 表明，在實驗范圍內(nèi)，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值為8.5時酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率均達到最高值，分別為0.39、44.19%和55.45%。后續(xù)實驗選取酶解pH值為8.5。

2.1.5 酶解溫度

圖6 酶解溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

圖6 表明，酶解溫度在55 ℃時酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率均達到最高值，分別為0.42、43.42%和56.68%。但溫度高于55 ℃時，酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率急劇下降，這可能是由于溫度過高使酶賴以穩(wěn)定的二級與三級結(jié)構(gòu)鍵因分子劇烈運動而被打斷，導(dǎo)致堿性蛋白酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致堿性蛋白酶變性失活，酶解效果急劇下降[16]。后續(xù)實驗選取酶解溫度為55 ℃。

2.1.6 酶解時間

圖7表明，當(dāng)酶解90 min時，酶解產(chǎn)物的還原力、羥自由基清除率、DPPH自由基清除率均達到最高值，分別為0.41、44.67%和54.44%。后續(xù)實驗選取酶解時間為90 min。

圖7 酶解時間對酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of hydrolysis time on antioxidant activity of enzymatic hydrolysates

2.2 APG制備的Box-Behnken試驗設(shè)計與響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，選擇加酶量（A）、酶解pH值（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）4 個因素為自變量，羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和還原力為響應(yīng)值（Y1、Y2和Y3），設(shè)計四因素三水平試驗，共29 個試驗點，其中試驗號2、21、25、27、29為中心試驗，用以估計試驗誤差，其余為分析試驗。試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table2 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 回歸方程顯著性分析

正側(cè)位X線平片以及薄層CT掃描判斷，分別觀察椎間隙、椎體前緣、椎體側(cè)方、椎管內(nèi)的滲漏情況。測量手術(shù)椎體前緣和中部的椎體高度及后凸畸形Cobb角度的變化情況。椎體前緣和中部高度的變化用對照的鄰近椎體高度的百分比表達，即骨折椎體高度/鄰近對照椎體高度的平均值×100%。椎體前緣高度即骨折椎體上終板最前端與下終板最前端的距離，椎體中緣高度即骨折椎體上終板中點與下終板中點的距離，骨折椎體的正常高度由測量最近頭側(cè)、尾側(cè)未骨折椎體所得的平均數(shù)估計。后凸角是患椎上位椎體的上終板垂線與下位椎體的下終板垂線的交角。

以DPPH自由基清除率和還原力為響應(yīng)值時得到的結(jié)論與羥自由基清除率一致，因此以下分析僅以羥自由基清除率為例。

利用SAS 8.0軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行二次線性回歸擬合，得到數(shù)學(xué)模型：

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fi tted quadratic response surface regression model

從表3可知，以羥自由基清除率為響應(yīng)值時，模型P＝0.001 9＜0.01，表明該二次方程模型顯著。同時失擬P＝0.070 3＞0.1，表示模型失擬不顯著，說明響應(yīng)面試驗結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合度較好，且該回歸模型能對APG的制備效果進行較好地分析與預(yù)測。用各因素的F值可評價該因素對試驗指標(biāo)的影響，F(xiàn)值越大，說明該因素的影響越顯著[17]，即各因素對羥自由基清除率的影響順序為：酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度＞加酶量。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）代表模型的置信度，當(dāng)CV值小于10%時，說明模型的置信度良好，且CV值越低，模型的置信度越高[18]。本試驗的CV值為10.08%，說明本試驗的置信度較高。

2.2.3 酶解條件優(yōu)化及模型驗證

為檢驗Design Expert軟件分析得到最優(yōu)條件的準(zhǔn)確性，對所得最佳酶解工藝條件進行實驗驗證，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、添加堿性蛋白酶3%、在pH 8.5的體系中55 ℃酶解90 min，所得羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原力分別為（58.19±0.80）%、（60.27±1.73）%、0.49±0.01，實驗值分別與理論預(yù)測值（58.75%、60.59%、0.51）接近，說明該模型可較好地模擬和預(yù)測APG的制備工藝條件，并具有可行性。

2.3 模擬胃腸道消化對不同分子質(zhì)量APG的生物有效性的影響

2.3.1 模擬胃腸道消化對APG中游離氨基酸含量及組成的影響

表4 模擬胃腸消化中抗氧化肽氨基酸組成的變化Table4 Changes in amino acid composition of antioxidant peptideduring simulated gastrointestinal digestion

如表4所示，分子質(zhì)量小于3 kDa、3～5 kDa與大于5 kDa的APG樣品中分別含游離氨基酸18.97%、12.82%和10.24%，其中分子質(zhì)量3～5 kDa和大于5 kDa也含有部分游離氨基酸，原因可能是大分子肽對小分子游離氨基酸的吸附作用，還可能由于肽具有一定的空間結(jié)構(gòu)而使部分游離氨基酸難以通過超濾達到與肽完全分離的目的[19-20]。經(jīng)過胃部模擬消化2 h后，小于3 kDa的APG中游離氨基酸的總量從64.76 mg/g增加到94.63 mg/g，增幅為46.12%；3～5 kDa的樣品中游離氨基酸的含量從43.76 mg/g增加到88.97 mg/g，增幅為103.31%；大于5 kDa的樣品中游離氨基酸的總量從34.95 mg/g增加到82.30 mg/g，增幅為135.48%。再經(jīng)過腸道模擬消化2 h后，小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa的樣品中游離氨基酸總量分別增加到142.38、126.06 mg/g和115.80 mg/g，即增加119.86%、188.07%、231.33%。分子質(zhì)量3～5 kDa和大于5 kDa的樣品經(jīng)胃腸道消化4 h后，含游離氨基酸分別為41.72%、36.94%和33.93%，其余58%以上仍是以肽的形式存在。說明體外模擬胃腸消化主要是將大分子質(zhì)量的APG水解成小片段的肽而不是全降解為游離氨基酸，此結(jié)果與Adibi等[21]的研究結(jié)果一致。

如表4所示，小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa的樣品在模擬胃腸道消化過程中堿性氨基酸（賴氨酸、組氨酸、精氨酸）的釋放量較多，酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）的含量基本無變化，具有抗氧化活性的氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、蛋氨酸[22]含量增加較明顯。

2.3.2 模擬胃腸道消化對不同分子質(zhì)量APG分布的影響

表5 模擬胃腸消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Table5 Molecular mass distribution of antioxidant peptides during simulated gastrointestinal digestion%

由表5可知，消化前小于3 kDa的樣品中92.68%是分子質(zhì)量小于3 kDa的肽段，3～5 kDa樣品中80.53%是分子質(zhì)量3～5 kDa的肽段，大于5 kDa樣品中85.98%是分子質(zhì)量大于5 kDa的肽段。小于3 kDa樣品在模擬胃消化道過程中，分子質(zhì)量在500～3 000 Da的肽段減少了19.32%，而分子質(zhì)量小于500 Da的肽段增加了31.15%；在模擬腸道消化過程中，分子質(zhì)量在500～3 000 Da的肽段增加了5.04%（P＜0.05），而分子質(zhì)量小于500 Da的肽段卻增加了86.26%（P＜0.05），消化產(chǎn)物中主要由分子質(zhì)量小于500 Da的小分子肽段組成。3～5 kDa和大于5 kDa樣品消化結(jié)果與小于3 kDa的樣品結(jié)果類似。說明在模擬胃腸道消化過程中，大分子質(zhì)量的肽段被逐步降解，這意味著胃腸道消化過程中主要通過內(nèi)切方式對不同分子質(zhì)量APG進行水解，進一步驗證了胃蛋白酶和胰蛋白酶主要是將不同分子質(zhì)量APG水解成小片段肽，而胰蛋白酶相對于胃蛋白酶而言其水解能力更強。

分子質(zhì)量小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa樣品在模擬胃腸道消化過程中分子質(zhì)量分布的變化規(guī)律與其游離氨基酸變化規(guī)律一致。而且小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa樣品的消化最終產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于500 Da的肽段分別為73.50%、60.15%和53.30%。這說明小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa樣品經(jīng)模擬消化后主要以二肽、三肽和寡肽的形式存在，而不全是游離氨基酸。文獻報道，二肽和三肽不僅有利于人體快速吸收，而且具有良好的生物活性[23]。Zhu Lijuan等[24]發(fā)現(xiàn)大米的Alcalase水解產(chǎn)物在經(jīng)過模擬胃腸消化后，分子質(zhì)量大于4 500 Da的肽段逐漸減少，而分子質(zhì)量小于500 Da的肽段逐漸增加，與本研究結(jié)果一致。

2.3.3 模擬胃腸道消化對不同分子質(zhì)量APG抗氧化活性的影響

2.3.3.1 模擬胃腸道消化過程中APG的羥自由基清除能力變化

圖8 模擬胃腸消化中肽的羥自由基清除能力的變化Fig.8 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity of antioxidant peptides during in vitro simulated digestion

如圖8所示，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的空白樣品對羥自由基清除能力分別為68.50%、59.39%和47.87%。經(jīng)過胃蛋白酶消化0.5 h后，其羥自由基清除能力均顯著降低，分別為56.25%、49.06%和37.19%（P＜0.05）；繼續(xù)在胃里面消化1～2 h基本上沒有顯著改變。但經(jīng)過第二階段胰酶消化后，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的樣品對羥自由基清除能力分別提高到86.34%、76.65%和64.35%（P＜0.05），這與張淼[25]對玉米蛋白水解物經(jīng)過模擬胃腸道消化后產(chǎn)物的羥自由基清除能力大大增加的研究結(jié)果相似。綜上，經(jīng)過模擬胃腸道消化后，不同分子質(zhì)量的APG對羥自由基清除能力都有所提高，這可能是因為不同分子質(zhì)量的APG在消化后生成的肽段或游離氨基酸更容易供給質(zhì)子而具有更強的抗氧化活性[26-27]。

2.3.3.2 模擬胃腸道消化過程中APG的DPPH自由基清除能力變化

如圖9所示，消化前小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的樣品對DPPH自由基清除能力分別為70.52%、51.63%和29.74%。經(jīng)過胃蛋白酶消化0.5 h后，其清除能力分別提高到78.68%、59.34%和44.82%（P＜0.05），進一步用胃蛋白酶消化DPPH自由基清除能力均沒有顯著提高。在第二階段模擬腸道消化過程中，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa樣品經(jīng)過胰酶消化0.5 h后，DPPH自由基的清除能力分別從78.93%顯著降低至37.24%、從59.68%顯著降低至28.24%、從42.93%顯著降低至20.24%（P＜0.05）。第二階段模擬消化結(jié)束后，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa樣品的消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力分別只有35.37%、27.63%和20.05%。You Lijun等[28]研究模擬胃腸道消化中泥鰍多肽清除DPPH自由基清除能力在胃中沒有顯著變化，在腸道中顯著下降，與本研究結(jié)果一致。

圖9 模擬胃腸消化中肽的DPPH自由基清除能力變化Fig.9 Changes in DPPH radical scavenging capacity of antioxidant peptides during in vitro simulated digestion

由圖9可看出，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的樣品在模擬胃部消化階段對DPPH自由基清除能力要高于模擬腸道消化階段，這可能是由于模擬胃部消化過程中，更多的疏水性氨基酸側(cè)鏈被暴露[29]，而DPPH是一種油溶性的自由基，這就使得消化產(chǎn)物與DPPH自由基能夠更好地接觸反應(yīng)，從而獲得較高的DPPH自由基清除率；當(dāng)進入模擬腸道消化階段，更多的游離氨基酸和小肽的生成導(dǎo)致消化產(chǎn)物的親水性提升，不同分子質(zhì)量抗氧化肽模擬消化產(chǎn)物極性的增加使得它更難捕獲脂溶性的DPPH自由基從而降低了DPPH自由基清除率[30]。模擬胃部消化過程中，小于3 kDa比3～5 kDa和大于5 kDa的樣品具有更高的DPPH自由基清除率，可能此階段小于3 kDa比3～5 kDa和大于5 kDa樣品具有更多的疏水性氨基酸側(cè)鏈，而進入模擬腸道消化階段，大于5 kDa、3～5 kDa比小于3 kDa樣品具有更多親水性小肽及游離氨基酸，從而使DPPH自由基清除率水平低于小于3 kDa樣品。

2.3.3.3 模擬胃腸道消化過程中APG的還原力變化

圖10 模擬胃腸消化中還原力的變化Fig.10 Changes in reducing power of antioxidant peptides during in vitro simulated digestion

如圖10所示，消化前小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的樣品的還原力分別為0.457、0.358和0.291。經(jīng)過1 h的模擬胃消化后，還原力分別顯著降低到0.393、0.336和0.274（P＜0.05），進一步用胃蛋白酶消化1 h而還原力并沒有顯著變化（P＞0.05）。在第二階段模擬腸道消化過程中，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的樣品經(jīng)胰酶消化1 h后，還原力分別顯著提高至0.674、0.554、0.473（P＜0.05）。整個模擬消化過程結(jié)束后，小于3 kDa、3～5 kDa、大于5 kDa樣品的消化產(chǎn)物的還原力比消化前分別提高了50.98%、64.53%、67.35%，這與Zhu Lijuan等[24]對大米水解物在經(jīng)過模擬胃消化道消化1 h和模擬腸消化道消化2 h后產(chǎn)物的還原力大大增加的研究結(jié)果相似。

Dávalos等[31]研究發(fā)現(xiàn)酸性氨基酸或堿性氨基酸殘基對酶解物的抗氧化能力影響極大，主要是由于這些氨基酸的羥基和氨基參與了金屬離子的反應(yīng)。因此對于模擬胃腸道消化過程中3 種樣品的還原能力均先下降后上升這一實驗結(jié)果，原因可能是肽進入胃部消化階段后生成了較多的酸性氨基酸或堿性氨基酸殘基而阻礙了其抗氧化作用的發(fā)揮；隨著消化的進行，肽鍵不斷斷裂使更多極性或帶電荷的氨基酸側(cè)鏈基團暴露出來而使其還原能力逐漸提高[32]。模擬胃部消化過程中，小于3 kDa樣品比3～5 kDa和大于5 kDa樣品具有更高的還原力，可能原因是此階段3～5 kDa和大于5 kDa樣品比小于3 kDa樣品具有更多的酸性氨基酸或堿性氨基酸殘基，而進入模擬腸道消化階段，小于3 kDa樣品比3～5 kDa和大于5 kDa樣品具有更多極性或帶電荷的氨基酸側(cè)鏈基團，從而使其還原力高于3～5 kDa和小于3 kDa樣品。

3 結(jié) 論

APG制備的最佳工藝條件為：金瓜籽粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，添加堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，在pH 8.5的體系中55 ℃酶解90 min，在此條件下酶解產(chǎn)物的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原力分別為（58.19±0.80）%、（60.27±1.73）%、0.49±0.01。

在模擬胃腸道消化過程中，游離氨基酸的釋放主要在腸道中，小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的APG的最終消化產(chǎn)物中含游離氨基酸分別為41.72%、36.94%和33.93%，其主要是分子質(zhì)量小于500 Da的肽段，占比分別為73.50%、60.15%和53.30%。

不同分子質(zhì)量APG不僅能耐胃腸道的酶系，而且生成了一些抗氧化活性更強的肽段，使消化產(chǎn)物的抗氧化活性更高。小于3 kDa、3～5 kDa和大于5 kDa的APG經(jīng)模擬消化后的最終產(chǎn)物與消化前相比，羥自由基的清除能力分別提高到86.34%、76.65%和64.35%，還原力分別提高了50.98%、64.53%、67.35%。