電子束輻照對中華管鞭蝦原肌球蛋白免疫原性及其構象的影響

官愛艷，羅華彬，梅卡琳，張進杰，徐大倫，樓喬明，楊文鴿*，陸彤霞

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

作為聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織所確定的八大類主要食物過敏源之一，蝦、蟹等甲殼類引起的過敏反應極為頻繁，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，過敏患者食用后往往會引起嘔吐、腹瀉和皮疹等不良反應，嚴重者可能導致蕁麻疹、血管性水腫、哮喘等，給消費者健康帶來嚴重威脅[1-2]。因此，采用合適的處理手段降低蝦蟹類產(chǎn)品的致敏性十分重要。

中華管鞭蝦（Solenocera melantho）又稱紅蝦，資源豐富，是我國重要的海捕蝦之一，因其營養(yǎng)豐富、味甜鮮美而深受人們喜愛，但中華管鞭蝦也屬于易引起過敏反應的較常見食用蝦[3]。蝦類等甲殼動物的主要過敏原是原肌球蛋白（tropomyosin，TM），其是一種熱穩(wěn)定性蛋白，經(jīng)過一般的熱加工致敏性不會完全喪失[4-5]。研究表明，TM的致敏性與其結(jié)構密切相關，改變TM的結(jié)構會導致其致敏性的降低[6-7]。改變TM結(jié)構的方法包括超高壓、超聲波、輻照等物理法[8-10]及美拉德反應、酶水解等化學、生物法[11-12]，主要通過破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵、使蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂或者改變其活性基團促進TM的降解、交聯(lián)，從而破壞過敏原蛋白的空間結(jié)構。但由于影響到食品的外觀、口感、營養(yǎng)品質(zhì)或安全性等原因，在實際生產(chǎn)中這些消減食品致敏性的方法未能得到廣泛的應用。

作為一種非熱加工技術，輻照在食品保鮮、質(zhì)量與安全控制等方面已有廣泛研究和應用[13]。在殺菌的同時，電子束輻照對食品蛋白等生物大分子具有獨特的改性作用，可能通過導致過敏蛋白解聚、交聯(lián)、裂解以及結(jié)構的改變，繼而破壞其抗原決定簇，影響過敏蛋白的免疫原性。顧可飛等[14]認為輻照會促進食品中的水分產(chǎn)生自由基，并引發(fā)一系列的化學反應，破壞蛋白質(zhì)等生物大分子的構象，且破壞程度與輻照劑量成正相關；哈益明[15]分析了電離輻射對蛋白質(zhì)分子的作用，認為輻照在生物體內(nèi)產(chǎn)生的大量自由基可修飾氨基酸殘基，以填隙或替代方式部分破壞蛋白質(zhì)分子有序、均勻的自組織特性，從而導致蛋白質(zhì)結(jié)構和構象的改變，發(fā)生肽鏈的斷裂、聚合和交聯(lián)，使蛋白質(zhì)變性；Kume等[16]通過電子束輻照降低了卵清蛋白的致敏性，發(fā)現(xiàn)輻照能引起蛋白聚集、降解及疏水性變化，在一定程度上改變過敏原蛋白的抗原性；許舒婷等[17]利用電子束輻照花生，導致花生過敏原的生化性質(zhì)發(fā)生改變并降低其免疫原性；Li Zhenxing等[18]的研究發(fā)現(xiàn)電子束輻照能引發(fā)小清蛋白羰基化而降低大菱鲆魚肉的致敏性。但目前鮮見利用電子束輻照降低中華管鞭蝦TM致敏性的研究。本實驗以中華管鞭蝦為原料，提取其中的過敏原TM，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析TM組成及其含量變化，免疫印記法和間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測TM的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G結(jié)合能力變化，圓二色光譜（circular dichroism，CD）法和熒光光譜法檢測輻照對TM二級結(jié)構及其表面疏水性的影響，探究電子束輻照對TM免疫原性及其結(jié)構的影響，旨在為利用電子束輻照消減蝦類食品過敏提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮中華管鞭蝦（Solenocera melantho）購自寧波水產(chǎn)交易市場，每只質(zhì)量（13f2）g。

辣根過氧化物酶（hydrogen peroxide，HRP）標記的羊抗兔IgG抗體 北京全式金生物技術有限公司；兔抗中華管鞭蝦TM-IgG抗體 杭州華安生物有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB） 美國Sigma公司；8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（1-anilino-8-naphthalene-sulfonate，ANS）、標準蛋白Marker（11～180 kDa）、考馬斯亮藍R-250、0.45 μm聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）北京Solarbio科技公司；增強型化學發(fā)光底物（enhanced chemiluminescence，ECL）、TBST緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、137 mmol/L NaCl、質(zhì)量分數(shù)0.05%吐溫20，pH 7.6） 美國Thermo Fisher公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機 德國Thermo Scientific SORVALL公司；XF-D型內(nèi)切式勻漿機寧波新芝生物科技有限公司；DYCZ-40D型電泳儀北京六一儀器廠；Tanon-5200凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司；Inf i nite?M?200?PRO型多功能酶標儀 瑞士TECAN公司；J-1500型CD儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 中華管鞭蝦TM的分離純化及其抗體制備

參照傅玲琳等[19]的方法純化，并用10 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）透析，冷凍干燥得到TM干粉。ELISA檢測純化后的兔抗中華管鞭蝦TM-IgG抗體效價達到1∶60 000。

1.3.2 TM的電子束輻照處理

用10 mmol/L PBS（pH 7.5）溶解TM干粉，配制成2 mg/mL TM溶液，分裝于聚乙烯袋中，真空密封。采用NBL-1010型電子直線加速器（能量10 MeV）在不同輻照劑量（1、3、5、7、9 kGy）下處理，劑量率1 kGy/s，平均電流強度1?128?μA。吸收劑量通過分光光度法檢測，采用FWT-60薄膜劑量計標定，該劑量計經(jīng)中國計量科學院比對，劑量測量誤差小于3%。共6 組TM溶液用于指標分析，以未經(jīng)輻照處理（0 kGy）的TM溶液為對照組。

1.3.3 SDS-PAGE分離TM溶液

參考Wang Xiudan等[20]的方法并略作修改。分離膠和濃縮膠體積分數(shù)分別為15%和5%，每孔TM溶液上樣量為5?μL。起始電壓100 V，待溴酚藍移至濃縮膠與分離膠的交界處改為80 V，考馬斯亮藍R-250染色，脫色后使用凝膠成像儀拍照。

1.3.4 免疫印跡法測定TM溶液與IgG的結(jié)合能力

SDS-PAGE分離各組TM溶液，將蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，25 ℃用TBST緩沖液（含5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）脫脂奶粉）封閉，1 h后改用兔抗中華管鞭蝦TM-IgG抗體（用含0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液以體積比1∶10 000稀釋）封閉過夜（25 ℃、10 h），TBST緩沖液洗3 次，10 min/次。PVDF膜用HRP標記的羊抗兔IgG抗體（用含0.5%脫脂奶粉的TBST緩沖液以體積比1∶5 000稀釋）在25 ℃下孵育40 min，TBST緩沖液洗3 次，10 min/次。最后采用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 ELISA法檢測TM與IgG的結(jié)合能力

參考Tong Ping等[21]的方法并略作修改。通過BCA法將各組TM溶液用pH 9.6的Na2CO3/NaHCO3緩沖液稀釋到0.5 mg/mL并加至酶標板，每孔50?μL，包被過夜（4 ℃、10 h）。用180?μL?TBST緩沖液洗板3 次，拍干后每孔加入封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液）200?μL，37 ℃下包被1 h。棄封閉液，用TBST緩沖液洗板，拍干。每孔加入50?μL兔抗中華管鞭蝦TM-IgG抗體（用封閉液以體積比1∶2 500稀釋），37 ℃下孵育1 h。用TBST緩沖液洗板，拍干后每孔加入50?μL?HRP標記的羊抗兔IgG二抗溶液（用封閉液以體積比1∶10 000稀釋），37 ℃下孵育45 min。用TBST洗板3 次，拍干。每孔加入100?μL?TMB底物溶液顯色，37 ℃放置5 min，每孔加入90?μL?2?mol/L H2SO4終止液，酶標儀檢測各孔OD450nm值。

1.3.6 CD法分析TM的二級結(jié)構

各組TM溶液（1 mg/mL）分別加入0.2 mm色譜池，CD掃描波長為190～250 nm，掃描速率50 nm/min，帶寬1.0 nm，響應時間2 s，連續(xù)掃描3 次，取平均值，以20 mmol/L PBS作為空白。結(jié)果使用系統(tǒng)自帶軟件進行分析，用Yang等[22]的方法估算二級結(jié)構含量。

1.3.7 熒光光譜法檢測TM的表面疏水性

參考Kato等[23]的方法并略作修改。用20 mmol/L PBS（pH 7.5）稀釋TM溶液，使蛋白質(zhì)量濃度在0.1～1.0 mg/mL之間。取不同質(zhì)量濃度的樣品1 mL，加ANS溶液10?μL，振蕩后靜置3 min，設定激發(fā)波長λex為370 nm，發(fā)射波長λem為490 nm，檢測熒光強度，以熒光強度對蛋白質(zhì)量濃度作圖并外推至蛋白質(zhì)量濃度為0 mg/mL，曲線初始階段斜率即為TM樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗平行次數(shù)為3 次，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，差異水平為0.05，使用Origin 9.0軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照劑量對TM含量的影響

圖1 不同輻照劑量條件下TM溶液的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of TM irradiated with different EB doses

TM的分子質(zhì)量約為36 kDa，由圖1可見，電子束輻照導致TM溶液中的TM含量降低，且隨輻照劑量的增加，TM含量的下降更明顯，原因可能是輻照使TM發(fā)生降解或聚集。

2.2 電子束輻照劑量對TM溶液免疫原性的影響

圖2 不同輻照劑量條件下TM溶液的免疫印跡檢測圖譜Fig.2 Western blot patterns of TM irradiated with different EB doses

利用免疫印跡法進一步確定電子束輻照對TM溶液免疫原性的影響。由圖2可知，對照組TM溶液的IgG結(jié)合能力最強，隨輻照劑量的增加，所測TM溶液的IgG結(jié)合能力逐漸降低，尤其是經(jīng)5 kGy及以上劑量輻照處理后，TM與IgG的結(jié)合能力顯著降低，至9 kGy輻照處理時TM溶液已基本喪失IgG結(jié)合能力。這主要是由于輻照使TM含量下降；另一個原因可能是輻照導致TM結(jié)構變化使其IgG結(jié)合能力下降。免疫印跡檢測結(jié)果表明，對TM溶液進行電子束輻照處理可使TM免疫原性降低，且電子束輻照劑量越高，降低效果越明顯。

2.3 電子束輻照劑量對TM與IgG結(jié)合能力的影響

在將輻照后的TM溶液調(diào)至同一質(zhì)量濃度的基礎上，由圖3可知，與對照組相比，電子束輻照處理能顯著降低TM的IgG結(jié)合能力，且隨輻照劑量的增加降低效果更明顯。經(jīng)1 kGy電子束輻照處理后，TM的IgG結(jié)合能力下降了34.45%，1 kGy和3 kGy組差異不顯著，但與高劑量組相比差異顯著。當電子束輻照劑量超過5 kGy時TM的IgG結(jié)合能力顯著下降，尤其經(jīng)9 kGy電子束輻照處理后TM的IgG結(jié)合能力顯著下降了50.53%。這可能是因為輻照使TM結(jié)構發(fā)生了變化；另一個原因可能是輻照使TM發(fā)生部分降解。

圖3 不同輻照劑量條件下TM與IgG的結(jié)合能力Fig.3 IgG-binding capability of TM irradiated with different EB doses

2.4 電子束輻照劑量對TM二級結(jié)構的影響

TM由兩個結(jié)構相同的亞基組成，利用不同方法在不同處理條件下分別進行解譜分析，所得到的各種TM的二級結(jié)構含量不同，但在天然TM中均以α-螺旋含量最高[24]。各組TM的CD圖譜見圖4，根據(jù)圖4通過軟件估算TM各二級結(jié)構含量，結(jié)果如圖5所示。

圖4 不同輻照劑量條件下TM的CD圖譜Fig.4 CD patterns of TM irradiated with different EB doses

圖5 不同輻照劑量條件下TM的二級結(jié)構含量Fig.5 Secondary structural composition of TM irradiated with different EB doses

由圖5可知，天然TM的二級結(jié)構中α-螺旋含量最高，其次為無規(guī)卷曲。經(jīng)電子束輻照，TM中的α-螺旋含量降低，而β-折疊和無規(guī)卷曲含量有所增加，且呈劑量-效應關系。與對照組相比，5 kGy組α-螺旋含量下降了55.38%，β-折疊和無規(guī)卷曲含量分別增加了102.08%和28.62%，β-轉(zhuǎn)角含量基本不變。電子束輻照使TM結(jié)構中的α-螺旋遭到嚴重破壞，部分解旋為β-折疊或無規(guī)卷曲，分子無序結(jié)構比例上升，表明電子束輻照會破壞TM的空間結(jié)構，導致TM免疫原性的變化。

2.5 電子束輻照劑量對TM表面疏水性的影響

圖6 不同輻照劑量條件下TM的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of TM irradiated with different EB doses

由圖6可知，經(jīng)電子束輻照處理后，中華管鞭蝦TM的表面疏水性指數(shù)顯著升高，且隨著輻照劑量的增加逐漸升高。與對照組相比，經(jīng)1、3、5、7、9 kGy電子束輻照處理，TM的表面疏水性指數(shù)分別增加了33.22%、100.31%、123.87%、167.94%和170.56%，7 kGy和9 kGy組TM的表面疏水性指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。表明電子束輻照處理使TM的空間構象發(fā)生變化，其表面疏水性增強。

3 討 論

由SDS-PAGE結(jié)果可知，隨電子束輻照劑量的增加，尤其是達到5 kGy及以上時，中華管鞭蝦TM溶液中的TM含量明顯降低，表明電子束輻照對TM具有降解或聚集作用，這與前人的研究結(jié)果類似。劉光明等[25]發(fā)現(xiàn)高劑量電子束輻照能降解蟹類過敏蛋白；Kume等[16]認為電子束輻照能引起卵清蛋白聚集、降解及疏水性改變；張立敏[26]研究了電子束輻照對大菱鲆TM的影響，顯示TM組分沒有明顯變化，含量隨輻照劑量的增加而降低，輻照劑量達5 kGy以上能有效降低大菱鲆蛋白過敏原的免疫原性。由SDS-PAGE、免疫印跡和ELISA結(jié)果可知，電子束輻照降低了中華管鞭蝦TM與IgG結(jié)合能力，這一方面是因為輻照使TM含量有所降低；另一方面可能是因為輻照導致TM結(jié)構變化使其免疫原性降低。且由同一質(zhì)量濃度下的ELISA結(jié)果可知，隨輻照劑量的升高，電子束輻照對TM免疫原性的降低效果越明顯。廖濤等[27]研究輻照對TM生化特性的影響，發(fā)現(xiàn)TM的免疫原性也隨著輻照劑量的增加而降低；Li Zhenxing等[28-29]分別研究了g射線輻照和熱處理對蝦抗原性的影響，發(fā)現(xiàn)隨輻照劑量的增加，蝦過敏原的免疫原性逐漸降低；Byun等[9]研究了g射線輻照對棕蝦主要過敏原的構象及抗原性的影響，發(fā)現(xiàn)棕蝦過敏原對病人IgE的結(jié)合能力呈劑量依賴性減少。

過敏蛋白結(jié)構的變化會導致其免疫原性的改變[30-31]，電子束輻照后TM潛在致敏性的降低與輻照對其蛋白質(zhì)結(jié)構上的影響息息相關。蛋白分子中的α-螺旋依賴—CO和—NH之間的氫鍵而形成穩(wěn)定的螺旋構象，輻照后中華管鞭蝦TM所含的α-螺旋含量減少，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，表明電子束輻照引起TM解螺旋，TM的α-螺旋結(jié)構遭到破壞，緊密而規(guī)則的構象單元部分轉(zhuǎn)變?yōu)檩^無規(guī)則的構象，同時大量疏水基團暴露在分子表面，導致表面疏水性升高，表明電子束輻照改變了中華管鞭蝦TM的空間構象。Long Fangyu等[8]研究了高壓和熱處理對蝦TM潛在致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)超高壓可破壞蛋白質(zhì)分子中的非共價鍵，使蛋白多肽鏈發(fā)生去折疊甚至降解，破壞或修飾過敏蛋白的抗原表位，改變了蛋白結(jié)構和物理特性，進而影響到蛋白質(zhì)的功能；Lü Liangtao等[32]研究丙二醛對蝦TM的氧化修飾對其致敏性的影響，發(fā)現(xiàn)帶活性基團的丙二醛可以和TM的氨基酸側(cè)鏈發(fā)生反應，導致TM結(jié)構及其致敏性發(fā)生變化?？梢奣M的致敏性降低與其結(jié)構的變化相關。Li Zhenxing等[18]研究輻照和熱處理對蝦致敏性的影響，認為其致敏性的降低可能是由于輻照和熱處理過程中產(chǎn)生的自由基作用于過敏原，導致過敏原蛋白二級結(jié)構去折疊，使暴露在蛋白表面的抗原表位遭到破壞，導致了蝦致敏性的顯著下降。

電子束輻照消減中華管鞭蝦TM的免疫原性，原因可能在于輻照導致TM溶液中產(chǎn)生大量自由基，這些自由基攻擊TM抗原決定簇的活性基團，破壞其構象單元結(jié)構，使TM分子的α-螺旋含量下降，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加，使TM分子有序、均勻的空間構象遭到破壞，大量疏水性殘基暴露于分子表面；同時發(fā)生蛋白肽鏈的裂解或聚集，使TM結(jié)合IgG的能力降低，尤其是當輻照劑量高達5、7、9 kGy時，TM免疫原性的降低更為顯著。電子束輻照有望用于降低中華管鞭蝦及其制品的潛在致敏性。