氣調(diào)包裝的調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片在微凍貯藏過(guò)程中的微生物群落多樣性分析

吳燕燕，錢(qián)茜茜,2，朱小靜,2，李來(lái)好，楊賢慶，胡 曉，林婉玲

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

鱸魚(yú)富含蛋白質(zhì)、高不飽和脂肪酸和多種維生素及有益的微量元素，肉質(zhì)滑嫩鮮美，深受消費(fèi)者喜歡[1-2]。但鱸魚(yú)在貯藏過(guò)程中極易因微生物的作用而腐敗變質(zhì)，微生物是其貨架期的決定性影響因素[3]。鱸魚(yú)魚(yú)肉中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)特別適合微生物的生長(zhǎng)[4]，Parlapani等[5]研究表明，魚(yú)種類(lèi)、貯存方式、加工條件、包裝方法等在不同外界條件對(duì)腐敗性微生物的生長(zhǎng)與代謝有極大的影響。長(zhǎng)期以來(lái)，在延長(zhǎng)魚(yú)肉貨架期、控制腐敗微生物的生長(zhǎng)方面，人們主要研究了不同品種魚(yú)肉的加工方式、貯藏方法，以及加工貯藏過(guò)程微生物的種類(lèi)和變化規(guī)律。

微生物群落多樣性的研究大多還是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，通過(guò)表型和生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力，而且不能對(duì)其精確鑒定，更難以獲得微生物群落多樣性的真正概貌[6]。因?yàn)橛行┪⑸锏呐囵B(yǎng)條件非常苛刻，甚至不可培養(yǎng)，常規(guī)方法難以檢測(cè)到不可培養(yǎng)的微生物。近年來(lái)，在微生物群落多樣性研究中已經(jīng)越來(lái)越傾向于采用分子生物學(xué)手段[7-10]，該技術(shù)以細(xì)菌基因序列信息為基礎(chǔ)，通過(guò)細(xì)菌的基因序列來(lái)研究水產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中微生物（尤其是優(yōu)勢(shì)腐敗菌）的組成及變化，與傳統(tǒng)研究方法相比，其不需要對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，就能夠快速檢測(cè)出大量未培養(yǎng)的微生物，而且具有重現(xiàn)性高、工作量少等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。而16S rDNA被認(rèn)為是最適于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)鑒定的指標(biāo)，通常作為揭示生物物種的特征核酸序列，16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序是對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定[13]，這樣分析數(shù)據(jù)時(shí)既可以提高效率還可以節(jié)省成本。

本研究主要采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)研究調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片采用氣調(diào)包裝在－3 ℃貯藏過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)差異及優(yōu)勢(shì)腐敗菌組成，并與未經(jīng)調(diào)理處理的鱸魚(yú)片比較，以期探究貯藏過(guò)程的微生物群落結(jié)構(gòu)及差異，為更好地抑制腐敗菌的生長(zhǎng)、優(yōu)化產(chǎn)品工藝、延長(zhǎng)啤酒鱸魚(yú)調(diào)理產(chǎn)品貨架期、提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活海鱸魚(yú)（Lateolabrax japonicus）500～600 g/條，體長(zhǎng)30～40 cm，購(gòu)自廣州華潤(rùn)萬(wàn)家超市。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega科技公司；高效和高保真酶Phusion?High-Fidelity聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix with GC Buffer 美國(guó)New England BioLabs公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MAP-D400復(fù)合氣調(diào)包裝機(jī) 蘇州森瑞保鮮設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；DZ-500/2D真空包裝機(jī) 溫州市新泰包裝機(jī)械廠；MM-2快速旋渦混合器 姜堰市沈高康健生化器具廠；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Bio-Rad公司；HiSeq PE250美國(guó)Illumina公司；GeneJET膠回收試劑盒 美國(guó)Thermo Scientif i c公司。

引物515F和806R由北京諾禾致源生物信息科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

處理組調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片加工工藝流程參考文獻(xiàn)[14]，具體為：鮮活鱸魚(yú)→預(yù)處理→取魚(yú)片→脫脂→脫腥、抑菌→調(diào)味→瀝干→包裝→貯藏。

其中將調(diào)味并風(fēng)干表面水分的調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片進(jìn)行包裝時(shí)，采用具有氣體高阻隔性能的包裝袋進(jìn)行氣調(diào)包裝（V（CO2）∶V（N2）＝3∶7），置于－3 ℃條件下進(jìn)行微凍貯藏，記為T(mén)L組；對(duì)照組將鮮活鱸魚(yú)去鱗去內(nèi)臟，沿魚(yú)的脊背骨從頭到尾分別剖下魚(yú)兩側(cè)的魚(yú)肉片（未作調(diào)味處理），采用真空包裝，置于4 ℃條件下進(jìn)行貯藏，記為L(zhǎng)組。

取樣方式：根據(jù)之前貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合硫代巴比妥酸值、揮發(fā)性鹽基氮含量、菌落總數(shù)和感官等指標(biāo)綜合考慮，上述處理?xiàng)l件下的調(diào)理鱸魚(yú)片可以貯藏40～50 d[14]，確定兩種包裝方式下取樣分析的時(shí)間。TL組產(chǎn)品在－3 ℃貯藏的第0、10、20、30、40、50天取樣，貯藏前期（0～10 d）、中期（20～30 d）、后期（40～50 d）分別記為B.1、B.2、B.3。L組產(chǎn)品在4 ℃貯藏的第0、2、4、6、8、10天取樣，貯藏前期（0～2 d）、中期（4～6 d）、后期（8～10 d）分別記為A.1、A.2、A.3；TL、L后面數(shù)字代表取樣時(shí)間。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2 次重復(fù)，取數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行分析。

1.3.2 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

利用試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，提取之后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，然后取適量的樣品放在離心管中，用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)細(xì)菌的16S rDNA V4片段擴(kuò)增的通用引物（515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’、806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’），并用高效和高保真酶Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

PCR體系：4 μL Primer Cocktail、25 μL Master Mix、2 μL DNA和19 μL ddH2O。反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后對(duì)目的條帶使用GeneJET膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物。

1.3.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，并用Qubit和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）定量，檢測(cè)文庫(kù)合格后，采用HiSeq2500 PE250測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)使用FLASH軟件進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)[15-18]。然后對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類(lèi)分析。根據(jù)分析結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋?zhuān)@得對(duì)應(yīng)的物種信息和豐度分布情況；同時(shí)對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、α-多樣性計(jì)算、Venn圖和花瓣圖分析，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息及不同樣品或分組間共有、特有OTUs信息等[19-20]。為進(jìn)一步挖掘分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異，采用LEfSe、T-test、MetaStat、Anosim和MRPP等統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，通過(guò)對(duì)OTUs進(jìn)行豐度和α-多樣性分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱸魚(yú)片在貯藏過(guò)程中微生物α-多樣性分析

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves

在0～10 000的測(cè)序數(shù)量范圍內(nèi)，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線（圖1）急劇上升，且斜率較大，在10 000～40 000的測(cè)序數(shù)量范圍內(nèi)，稀釋曲線緩慢上升并趨向平坦，進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明本研究測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)試深度足以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息，即使再增加測(cè)序數(shù)量也不會(huì)產(chǎn)生新的OTU。

圖2 鱸魚(yú)片在貯藏過(guò)程中微生物α-多樣性指數(shù)的箱圖Fig.2 Boxplots of alpha diversity indexes of sea bass fi llets during storage

A、B兩組樣品的α-多樣性指數(shù)箱圖見(jiàn)圖2，其中物種觀察指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，香農(nóng)指數(shù)反映群落的多樣性。鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中微生物多樣性逐漸趨向單一，調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片B.1組的微生物多樣性比對(duì)照組A.1低，但是在B.2組和B.3組微生物多樣性比對(duì)照組A.2和A.3豐富。魚(yú)肉在貯藏過(guò)程中由于自身酶和微生物的作用會(huì)分解成小分子蛋白質(zhì)或脂肪酸，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，引起微生物滋生。隨著貯藏過(guò)程的進(jìn)行，魚(yú)肉開(kāi)始腐敗，產(chǎn)生各種有機(jī)酸，酸性環(huán)境能有效抑制微生物的繁殖，再加上低溫環(huán)境對(duì)微生物的抑制作用；因此菌相逐漸變得單一，這與謝萍等[21]研究的結(jié)果一致，即在貯藏前期和中期微生物快速增長(zhǎng)，而后又開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片調(diào)味前采用天然植物香菜和檸檬草進(jìn)行脫腥抑菌處理，且調(diào)味料中的啤酒和鹽對(duì)微生物有一定的抑制作用，因此調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片微生物多樣性低于對(duì)照組。隨著貯藏過(guò)程的進(jìn)行，魚(yú)肉開(kāi)始出現(xiàn)汁液流失，調(diào)味料的加入使得魚(yú)肉環(huán)境更加復(fù)雜，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在一些酶的作用下降解成小分子肽或氨基酸，更有利于微生物滋生。

2.2 OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)及物種注釋分析

圖3 樣品的Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of Tags and OTUs numbers in samples

由圖3可知，對(duì)照組L0過(guò)濾后得到的拼接序列數(shù)共有58 707 條Tags，在97%的序列相似性條件下，可分為766 個(gè)OTUs，包括54 422 條可獲得分類(lèi)信息的Tags，4 275 條低頻Tags；而實(shí)驗(yàn)組TL0共獲得64 345 條Tags，在97%的序列相似性條件下，可分為210 個(gè)OTUs，包括63 906 條可獲得分類(lèi)信息的Tags，422 條低頻Tags（圖3）。從這些數(shù)據(jù)可以看出，調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片在加工過(guò)程中由于用啤酒、鹽等調(diào)味腌制一段時(shí)間，并有一定時(shí)間的風(fēng)干工序，魚(yú)肉中的蛋白質(zhì)和脂肪在這個(gè)過(guò)程發(fā)生降解，分解成小分子肽、氨基酸、脂肪酸等物質(zhì)，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了營(yíng)養(yǎng)條件；因此微生物多樣性較對(duì)照組豐富，但調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片中的微生物種類(lèi)比較單一。這與梁榮蓉[22]、范曉攀[23]等研究雞肉調(diào)理制品時(shí)發(fā)現(xiàn)不同品種的雞肉調(diào)理產(chǎn)品總體微生物總數(shù)偏高，但菌群結(jié)構(gòu)存在差異，與產(chǎn)品的加工調(diào)制方式、貯藏溫度和包裝方式等有密切關(guān)系的結(jié)論相一致。

2.3 OTU花瓣圖分析

圖4 鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中細(xì)菌OTU花瓣圖Fig.4 OTU petal map of sea bass fi llets during storage

為了找出不同貯藏階段樣品中的核心微生物，利用OTU花瓣圖作進(jìn)一步分析。圖4A、B為鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中細(xì)菌OTU花瓣圖分析結(jié)果，可以很直觀地看出，在不同的貯藏時(shí)間，細(xì)菌多樣性存在很大差異，但各個(gè)貯藏時(shí)間里又都含有共同的OTU數(shù)。調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片TL組在微凍貯藏0～50 d過(guò)程中共有61 個(gè)核心OTU，對(duì)照組（L組）在4 ℃貯藏0～10 d過(guò)程中共有21 個(gè)核心OTU，說(shuō)明鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中有些微生物一直存在，對(duì)魚(yú)肉的品質(zhì)變化有重大影響。圖4C為鱸魚(yú)制品在兩種不同包裝不同貯藏條件下的細(xì)菌OTU花瓣圖分析結(jié)果，魚(yú)肉在不同包裝方式和不同貯藏條件下，核心優(yōu)勢(shì)微生物共有75 個(gè)核心OTU。

2.4 物種的分布情況

2.4.1 基于門(mén)水平的菌群結(jié)構(gòu)分析

圖5 鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中門(mén)水平上的微生物相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of bacteria at the phylum level of sea bass fi llets during storage

圖5 從門(mén)水平描述了鱸魚(yú)制品貯藏過(guò)程微生物菌群結(jié)構(gòu)變化。本實(shí)驗(yàn)自定義最大豐度排名前10的菌群為優(yōu)勢(shì)菌群。鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物為：厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），且在整個(gè)貯藏過(guò)程存在，說(shuō)明這3 種微生物對(duì)鱸魚(yú)的品質(zhì)起著重要的作用，在今后的研究中可以重點(diǎn)探究其在鱸魚(yú)品質(zhì)變差的過(guò)程中的作用。對(duì)照組中的優(yōu)勢(shì)微生物厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度在4 ℃冷藏過(guò)程中先上升后下降，變形菌門(mén)相對(duì)豐度在整個(gè)貯藏過(guò)程中持續(xù)上升，在貨架期終點(diǎn)時(shí)達(dá)到最高，為73.2%，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度則在4 ℃冷藏過(guò)程中持續(xù)下降。氣調(diào)包裝的調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片中的優(yōu)勢(shì)微生物厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度在整個(gè)－3 ℃微凍過(guò)程變化幅度不大，變形菌門(mén)相對(duì)豐度呈微弱上升的趨勢(shì)，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度逐漸較小。這與范曉攀等[23]研究的肉類(lèi)調(diào)理食品在門(mén)分類(lèi)水平上微生物主要是變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，這兩類(lèi)細(xì)菌占總菌數(shù)的80%～90%左右的結(jié)論基本一致，實(shí)驗(yàn)組中的微生物多樣性不如對(duì)照組豐富。

2.4.2 基于屬水平的菌群結(jié)構(gòu)分析

圖6是選擇豐度排名前35的屬，結(jié)合每個(gè)樣品中的豐度信息，從物種的層面進(jìn)行聚類(lèi)的物種豐度聚類(lèi)圖，由鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中的微生物豐度聚類(lèi)圖（圖6A）可知，對(duì)照組鱸魚(yú)片在貯藏第0天時(shí)優(yōu)勢(shì)菌為：鯨桿菌屬（Cetobacterium）、優(yōu)桿菌屬（Eubacterium）、另枝菌屬（Alistipes）。貯藏第2天時(shí)微生物發(fā)生了變化，優(yōu)勢(shì)菌以乳球菌屬（Lactococcus）、生絲微菌屬（Hyhomicrobium）、梭桿菌屬（Cetobacterium）為主。第4天時(shí)微生物以索絲菌屬（Brochothrix）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）為主，索絲菌廣泛存在于環(huán)境中，是肉類(lèi)食品中重要的腐敗菌，也是導(dǎo)致真空包裝肉制品在冷藏條件下腐敗的主要微生物。說(shuō)明從第4天開(kāi)始，對(duì)照組中的鱸魚(yú)片開(kāi)始出現(xiàn)索絲菌屬常見(jiàn)的腐敗微生物，品質(zhì)開(kāi)始變差，有腐敗變質(zhì)的跡象。第6～8天肉食桿菌屬、氣單胞菌屬（Aeromonas）快速生長(zhǎng)。第10天時(shí)，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、索絲菌屬、假單胞菌屬豐度迅速增大，甚至出現(xiàn)了希瓦氏菌屬（Shewanella），并且成為主要優(yōu)勢(shì)微生物，造成鱸魚(yú)片的徹底腐敗變質(zhì)。熊振海等[20]的研究表明假單胞菌和希瓦氏菌都具有很強(qiáng)的腐敗能力，是冷藏產(chǎn)品中主要的特定腐敗菌。

圖6 鱸魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中的微生物豐度聚類(lèi)圖Fig.6 Cluster heatmaps of bacterial genera based on relative abundance of sea bass fi llets during storage

調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片中的微生物群落結(jié)構(gòu)較對(duì)照組發(fā)生了變化，貯藏第0天主要包括克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、韋永氏球菌屬（Veillonella），而且還出現(xiàn)了一種新的微生物L(fēng)achnoclostridium；埃希氏桿菌屬的檢出說(shuō)明產(chǎn)品可能受到了一定程度的污染。第10天時(shí)優(yōu)勢(shì)微生物包括寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和未分類(lèi)的菌。第20天時(shí)鹽單胞菌屬（Halomonas）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）成為主要優(yōu)勢(shì)微生物，同時(shí)出現(xiàn)了假單胞菌屬和希瓦氏菌屬等腐敗菌。據(jù)研究報(bào)道，假單胞菌是導(dǎo)致冷藏肉腐敗變質(zhì)的主要優(yōu)勢(shì)菌[24-26]，能夠分解大分子蛋白質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的氨臭味，使其感官上不可接受，說(shuō)明調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片在第20天才開(kāi)始有變質(zhì)的跡象。這與Hovda等[27]研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)處理鱈魚(yú)中假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，氣調(diào)處理能明顯抑制嗜冷菌和產(chǎn)H2S菌的生長(zhǎng)結(jié)論是一致的。而鹽單胞菌屬的出現(xiàn)，也說(shuō)明調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片在腌制加工過(guò)程中，由于含有的鹽對(duì)微生物進(jìn)行了選擇和富集，出現(xiàn)了耐鹽的鹽單胞菌屬。第30～50天時(shí)優(yōu)勢(shì)微生物為皮生球菌屬（Dermacoccus）、庫(kù)克菌屬（Kocuria）、副球菌屬（Paracocccus）、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬，此外還出現(xiàn)了次要優(yōu)勢(shì)微生物嗜冷桿菌屬。嗜冷桿菌屬出現(xiàn)較晚，這與Torrieri等[28]研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)包裝在0～2 ℃對(duì)嗜冷菌也有抑制作用的結(jié)論相同。

由圖6B可以看出，氣調(diào)包裝的調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片中微生物種類(lèi)和豐度明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明氣調(diào)包裝中的CO2對(duì)微生物有一定的抑制作用。對(duì)照組鱸魚(yú)片在冷藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌的種類(lèi)波動(dòng)較大，A.1時(shí)存在的優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括密螺旋體屬（Treponema）、真桿菌屬（Eubacterium）、乳球菌屬、生絲微菌屬、梭桿菌屬，到了A.2時(shí)，菌相逐漸開(kāi)始變的單一，索絲菌屬、肉食桿菌屬開(kāi)始成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，貯藏A.3時(shí)，索絲菌屬、肉食桿菌屬減弱，漫游球菌屬（Vagococcus）豐度增強(qiáng)并成為優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)出現(xiàn)了較多的氣單胞菌屬（Aeromonas）、希瓦氏菌屬、嗜冷桿菌屬。氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬都屬于氧化三甲胺和H2S的產(chǎn)生菌，可使魚(yú)肉在貯藏過(guò)程中變色、發(fā)黏且產(chǎn)生不良?xì)馕禰29]。

而調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片－3 ℃微凍貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物種類(lèi)在貯藏B.1和B.2變化不大，但在貯藏B.3時(shí)發(fā)生了較大變化，整個(gè)貯藏過(guò)程中的微生物種類(lèi)也和對(duì)照組不同，說(shuō)明鱸魚(yú)的加工方式、包裝方式和貯藏溫度影響著微生物多樣性。貯藏B.1的主要優(yōu)勢(shì)菌為埃希氏桿菌屬、擬桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬，Lachnoclostridium為次要優(yōu)勢(shì)微生物，貯藏B.2時(shí)，之前的主要優(yōu)勢(shì)菌豐度逐漸減弱，次要優(yōu)勢(shì)微生物L(fēng)achnoclostridium的豐度增強(qiáng)，同時(shí)出現(xiàn)了鹽單胞菌、短波單胞菌屬，假單胞菌屬也開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖。假單胞菌廣泛存在于土壤、水和動(dòng)植物體表中，容易導(dǎo)致肉類(lèi)變黏，代謝產(chǎn)生過(guò)氧化物或H2S使肉類(lèi)變色。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)微生物結(jié)構(gòu)波動(dòng)較大，多樣性增加，假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬的主導(dǎo)地位越來(lái)越顯著，成為主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌；藍(lán)蔚青等[30]研究也表明氣調(diào)包裝的鯧魚(yú)在冷藏前期優(yōu)勢(shì)菌以革蘭氏陰性菌為主，貯藏后期優(yōu)勢(shì)菌以腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌與嗜冷桿菌為主，氣調(diào)處理對(duì)革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)有明顯抑制。這說(shuō)明氣調(diào)包裝和－3 ℃微凍貯藏能有效延緩假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬這類(lèi)腐敗菌的出現(xiàn)和快速生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。

3 結(jié) 論

加工方式、包裝方式和貯藏溫度對(duì)鱸魚(yú)片貯藏過(guò)程中微生物群落變化影響較大；鱸魚(yú)片在整個(gè)貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物為厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)。處理組在－3 ℃微凍貯藏過(guò)程的微生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于貯藏在4 ℃的對(duì)照組。對(duì)照組在貯藏第4天時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)了索絲菌屬等常見(jiàn)的腐敗微生物，到第10天時(shí)，索絲菌屬、假單胞菌屬豐度迅速增大，甚至出現(xiàn)了希瓦氏菌屬，造成鱸魚(yú)制品的徹底腐敗變質(zhì)。而處理組則在第20天時(shí)才開(kāi)始出現(xiàn)假單胞菌和希瓦氏菌屬等腐敗菌，之后在CO2的抑制作用下，腐敗菌豐度逐漸減小，直到貨架期終點(diǎn)時(shí)，假單胞菌才迅速增長(zhǎng)，并出現(xiàn)了嗜冷桿菌屬，導(dǎo)致鱸魚(yú)片的徹底腐敗變質(zhì)。采用啤酒等調(diào)味處理并經(jīng)氣調(diào)包裝和微凍貯藏，可有效抑制鱸魚(yú)腐敗菌的生長(zhǎng)，較好地延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期。

本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片的目的是為鱸魚(yú)加工提供新的技術(shù)，開(kāi)發(fā)當(dāng)今消費(fèi)者所需求的營(yíng)養(yǎng)健康、方便快捷、個(gè)性風(fēng)味的調(diào)理食品，延長(zhǎng)產(chǎn)品在流通銷(xiāo)售和食用的貨架期。通過(guò)分析其微生物群落多樣性，證明了采用啤酒調(diào)味加工技術(shù)的產(chǎn)品微生物多樣性更豐富，可使有益微生物成為優(yōu)勢(shì)菌，有利于該產(chǎn)品形成獨(dú)特風(fēng)味，而氣調(diào)包裝方式和－3 ℃微凍的貯藏條件可以有效抑制微生物的生長(zhǎng)，特別是腐敗菌的產(chǎn)生，從而延長(zhǎng)魚(yú)片的貨架期。該研究為具有特殊風(fēng)味和啤酒香味的調(diào)理啤酒鱸魚(yú)片的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)提供理論和技術(shù)依據(jù)。