高氧氣調(diào)包裝貯藏牛排肉色穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)組學(xué)

楊嘯吟，張一敏,2，朱立賢，毛衍偉，董鵬程，羅 欣,2,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

肉色能夠直觀地反映肉品的新鮮度和衛(wèi)生狀況，是影響消費者購買欲望的最重要指標(biāo)[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織2016年報道[2]，失色是導(dǎo)致消費者拒絕購買食用肉制品的主要原因，給肉品的生產(chǎn)和銷售帶來了巨大浪費，僅美國肉類行業(yè)每年就會因產(chǎn)品的失色問題造成高達10億 美元的經(jīng)濟損失。

氣調(diào)包裝技術(shù)可以通過改變?nèi)馄吩匈A藏環(huán)境中的氣體成分保護良好肉色并抑制微生物的生長，是一種被廣泛用來改善產(chǎn)品肉色的有效手段。目前全球市場上最流行的氣調(diào)包裝方式是采用體積分?jǐn)?shù)80% O2配合20%CO2的高氧氣調(diào)包裝。高氧環(huán)境可以促進肉的表面形成層次更深的氧合肌紅蛋白，使肉品呈現(xiàn)出誘人的鮮紅色，從而吸引消費者的購買。然而，肉品在高氧環(huán)境下長時間貯藏會加速氧合肌紅蛋白氧化成棕褐色的高鐵肌紅蛋白，導(dǎo)致貯藏后期肉品出現(xiàn)褐變失色現(xiàn)象[3]。

良好肉色的維持主要取決于肉色是否穩(wěn)定，通常高鐵肌紅蛋白還原能力（metmyoglobin reductase activity，MRA）和氧氣消耗率（oxygen consumption rate，OCR）是決定肉色穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)[4]。在肉品成熟過程中，涉及糖酵解、線粒體代謝活性的一些肌漿蛋白會影響肉中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、抗氧化物質(zhì)的含量以及高鐵肌紅蛋白還原酶的活性，進而影響肉品的MRA、OCR[5-6]?；陔p向電泳技術(shù)（two-dimensional electrophoresis，2DE）的蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以很好地分離并識別肌肉向肉品轉(zhuǎn)變過程中那些發(fā)生變化的差異蛋白，是研究肌肉宰后代謝進程的有力工具，然而目前有關(guān)肉色蛋白質(zhì)組學(xué)的研究還多集中于比較不同部位肉的肉色穩(wěn)定性差異上[6-8]，而且這些研究多為觀測宰后初期的蛋白表達量變化，對于長期貯藏過程中包裝方式對肉色影響的蛋白質(zhì)組學(xué)分析卻鮮有報道。

從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度來探究貯藏期間高氧氣調(diào)包裝牛排肉色穩(wěn)定性發(fā)生變化的原因，尋找與肉色相關(guān)的潛在蛋白質(zhì)生物標(biāo)簽，可以更好地了解高氧氣調(diào)包裝的護色機理，為控制貯藏后期的肉品失色問題提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的腰背最長肌均購自山東某肉牛屠宰企業(yè)的4 頭魯西黃牛（26～30 月齡，286～315 kg 胴體質(zhì)量，極限pH值為5.5～5.7），胴體在2～4 ℃下排酸48 h，然后取整塊西冷部位并真空包裝，將樣品置于冰上迅速運回實驗室進行分割。

甘油、亞硝酸鈉、甲醇、磷酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；尿素、甘氨酸、硫脲、二硫蘇糖醇（1,4-dithiothreitol，DTT）、3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、溴酚藍、瓊脂糖、考馬斯亮藍 北京索萊寶科技有限公司；IPG干膠條（24 cm，pH 3～10） 美國通用電氣醫(yī)療集團；非干擾型蛋白濃度測定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DT-6D氣調(diào)包裝機 中國大江機械設(shè)備有限公司；C200真空包裝機 德國莫迪維克包裝設(shè)備有限公司；SP62便攜式色差計 美國愛色麗儀器有限公司；T18高速分散機 德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國艾本德有限公司；Ettan IPGphor III等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳儀、ImageScanner III圖像掃描儀 美國通用醫(yī)療集團；5800基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of f l ight/time of f l ight，MALDI-TOF/TOF）質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品包裝

在實驗室將所有腰背最長肌分切成標(biāo)準(zhǔn)的2.54 cm牛排，然后隨機放入包裝盒內(nèi)進行80% O2＋20% CO2（以體積分?jǐn)?shù)計）高氧氣調(diào)包裝，頂隙空間比為3∶1，每個貯藏時間點有8 塊獨立包裝牛排作為重復(fù)實驗單元。將所有包裝放入2 ℃冷庫黑暗貯藏15 d，分別在第5、10、15天取出包裝并測定牛排的肉色指標(biāo)，進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。包裝前隨機取出8 塊牛排測定以下各項指標(biāo)作為第0天的初始指標(biāo)。

1.3.2 肉色常規(guī)指標(biāo)測定

第0天的牛排2 ℃下暴露于空氣中發(fā)色30 min后測定肉色，貯藏第5、10、15天的牛排在打開各自包裝后立即用便攜式色差計測定牛排的亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）。按照式（1）計算色彩飽和度。每個樣品重復(fù)測量6 次，取其平均值。

高鐵肌紅蛋白相對含量（即高鐵肌紅蛋白占總肌紅蛋白的相對比例）的測定參照文獻[9]。色差計記錄下400～700 nm波長之間所有間隔10 nm的反射率，根據(jù)線性關(guān)系計算出525 nm和572 nm波長處的反射率（R值），其對應(yīng)的吸收散射系數(shù)（K/S）根據(jù)Kubelka-Munk公式（K/S=（1?R）2/（2R））計算得出，再根據(jù)K/S在572 nm與525 nm波長處的比值計算出高鐵肌紅蛋白相對含量。

1.3.3 MRA測定

MRA測定參考Sammel等[10]提出的方法稍作改進。在牛排中央位置取2.54 cmh2.54 cmh2.54 cm立方體肉樣（無結(jié)締組織和脂肪），沿牛排展示面方向?qū)⒘⒎襟w一分為二，上層肉樣正面朝上浸泡在50 mL 3 g/L NaNO2溶液中，室溫放置20 min，然后取出肉樣，用濾紙擦干肉樣表面的NaNO2溶液，真空包裝，立即測量肉樣表面的反射率，計算此時的高鐵肌紅蛋白相對含量（即初始高鐵肌紅蛋白相對含量）；真空包裝的肉樣30 ℃下放置2 h，再次測定肉樣表面的反射率，每次掃描3 次，計算高鐵肌紅蛋白相對含量（最終高鐵肌紅蛋白相對含量）。MRA的計算見式（2）。

1.3.4 OCR測定

參考Madhavi等[11]提出的方法稍作改進。將下層肉樣鮮切面朝上在2 ℃空氣中發(fā)色30 min，真空包裝后直接用色差計掃描，并參考文獻[9]計算初始氧合肌紅蛋白相對含量，然后將包裝肉樣在30 ℃下放置30 min，再次掃描并計算氧合肌紅蛋白相對含量（最終氧合肌紅蛋白相對含量），每次掃描3 次。OCR的計算見式（3）。

1.3.5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.5.1 肌漿蛋白的提取

取2 g牛肉樣品，按1∶5（m/V）的比例加入提取液（40 mmol/L Tris-base、2 mmol/L EDTA，調(diào)pH值至8.0）、120 μL 2 mol/L DTT，冰浴勻漿，4 ℃下15 000hg離心20 min，取上清液即為肌漿蛋白，分裝凍藏（－80 ℃）備用。

1.3.5.2 一向等電聚焦

等電聚焦前，先用非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定樣品的蛋白濃度，然后對IPG干膠條進行上樣水化，上樣量為800 μg。采用Ettan IPGphor Ⅲ聚焦儀對泡脹好的膠條進行一向等電聚焦，設(shè)定聚焦程序為：300 V/1 h；1 000 V/1 h；grd 4 000 V/1 h；10 000 V/2.5 h；grd 10 000 V至80 000 V?h；grd 300 V/10 h。

1.3.5.3 二向聚丙烯酰氨凝膠電泳

聚焦結(jié)束后，分別用含10 g/L DTT和45 g/L IAA的膠條平衡緩沖液（含6 mol/L尿素、20 g/L SDS、體積分?jǐn)?shù)30%甘油、體積分?jǐn)?shù)0.002%溴酚藍）各4 mL去平衡膠條15 min。將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移到125 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠上端，將電泳緩沖液倒入電泳槽中。設(shè)置電泳儀參數(shù)：100 W電泳1 h，然后300 W下電泳約5 h，直到溴酚藍到達凝膠底部后關(guān)閉電泳，用考馬斯亮藍染色液對凝膠染色。

1.3.5.4 圖像掃描與質(zhì)譜識別

將染色后的凝膠取出放入脫色液（體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸）中搖晃脫色，多次更換脫色液至蛋白點清晰可見，通過圖像掃描儀對脫色后的凝膠進行掃描獲得圖譜，尋找差異蛋白質(zhì)點。采用質(zhì)譜儀對差異蛋白進行質(zhì)譜檢測，主要操作過程為：切膠→膠內(nèi)酶解→ZipTip脫鹽→抽提酶解肽段→MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。最后用UniProt數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行檢索，識別差異蛋白的種類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SSPS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，并計算Pearson相關(guān)系數(shù)，P＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用PDQuest軟件對不同貯藏時間組之間的同類蛋白進行圖譜匹配，并分別將第5、10、15天的蛋白質(zhì)豐度與第0天相對應(yīng)的蛋白質(zhì)豐度進行比較，兩組間蛋白豐度相差1.5 倍以上且有顯著差異（P＜0.05）的蛋白點為差異蛋白點。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝冷卻牛排肉色指標(biāo)變化

如表1所示，牛排的L*值在貯藏的0～10 d內(nèi)顯著升高（P＜0.05），并在貯藏后期一直維持較高的穩(wěn)定水平，說明高氧氣調(diào)包裝可以賦予牛排較好的亮度。貯藏前期，牛排具有較高的a*值和色彩飽和度，這主要是由于氧合肌紅蛋白的大量形成以及肉品具有較高的肉色穩(wěn)定性，但貯藏5 d后二者隨貯藏時間延長快速下降（P＜0.05）。b*值在15 d內(nèi)也表現(xiàn)出類似于a*值先增高后降低的變化趨勢。伴隨著a*值和色彩飽和度的下降（貯藏5～15 d內(nèi)），貯藏期間牛排的高鐵肌紅蛋白相對含量隨貯藏時間延長顯著升高（P＜0.05），這些都預(yù)示著牛排的肉色穩(wěn)定性不斷降低，失色現(xiàn)象正在逐漸發(fā)生。Estévez[12]的研究表明高氧環(huán)境會損耗并破壞肉中的還原系統(tǒng)，促使氧合肌紅蛋白氧化成為高鐵肌紅蛋白，從而加速了牛排的褐變速率。

表1 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝冷卻牛排的肉色指標(biāo)變化Table1 Changes in meat color traits of HiOx-MAP steak during chilled storage

2.2 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝牛排MRA和OCR的變化

圖1 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝冷卻牛排MRA和OCR變化Fig.1 Changes in MRA and OCR of HiOx-MAP steak during chilled storage

MRA是指肉中的還原系統(tǒng)把高鐵肌紅蛋白還原成脫氧肌紅蛋白的能力，通常肉色穩(wěn)定性與MRA之間存在較高的正相關(guān)性[13]。OCR是指肉中線粒體消耗氧氣的速率，成熟過程中肉品內(nèi)部的線粒體活性會不斷降低而且其形態(tài)也會發(fā)生改變，進而導(dǎo)致OCR的下降，肉色穩(wěn)定性也隨之降低[13]。由圖1可知，貯藏期間牛排的MRA隨時間延長而快速降低（P＜0.05），這可能引發(fā)了高鐵肌紅蛋白的大量積累，從而導(dǎo)致高氧氣調(diào)包裝牛排在貯藏后期a*值和色彩飽和度的快速下降；貯藏期間牛排OCR也顯著下降（P＜0.05），有研究表明線粒體的結(jié)構(gòu)在較高的氧氣濃度下會遭到破壞，例如，一些脂質(zhì)氧化產(chǎn)物就能破壞線粒體的膜結(jié)構(gòu)，進而降低其活性[14]。高氧氣調(diào)包裝牛排的肉色穩(wěn)定性在貯藏后期出現(xiàn)快速下降，這可能與高氧環(huán)境加速了肉中MRA和OCR的下降有關(guān)。

2.3 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝牛排的肌漿蛋白變化

通過質(zhì)譜，本研究共鑒定出20 個可信度大于95%的差異蛋白質(zhì)點，這些蛋白點在凝膠圖像中的位置如圖2所示，與之對應(yīng)的蛋白名稱、檢索號、分子質(zhì)量、等電點、蛋白得分、肽段數(shù)、序列覆蓋率和差異倍數(shù)如表2所示。這些差異蛋白質(zhì)主要是一些代謝酶類、伴侶蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、抗氧化蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白等，其中代謝酶類是最主要的蛋白質(zhì)種類。共發(fā)現(xiàn)了8 種代謝酶，其中4 種酶類主要參與了糖酵解進程，包括果糖-二磷酸醛縮酶、丙酮酸激酶（點6624和點4422）、3-磷酸甘油醛脫氫酶和果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2，還發(fā)現(xiàn)了參與三羧酸循環(huán)代謝的蘋果酸脫氫酶和黃素還原酶，這些酶類的蛋白表達量隨貯藏時間的延長出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。對于結(jié)果中出現(xiàn)的同一種蛋白對應(yīng)不同蛋白點的現(xiàn)象，在其他文獻中也都有類似報道，其可能是蛋白翻譯后的修飾現(xiàn)象（磷酸化、乙?；龋⒉煌鞍讈喰偷拇嬖?，以及蛋白質(zhì)的碎片化等導(dǎo)致的[15-17]。在動物宰后肌肉向肉品轉(zhuǎn)化的過程中，肌肉中的生化反應(yīng)和能量代謝并沒有立即停止，而是進行糖酵解等代謝途徑，并伴隨著NADH和少量ATP的生成。在這一過程中，糖酵解酶和一些能量代謝酶類的活性通常會影響宰后肌肉的顏色、嫩度以及保水性等，對肉的品質(zhì)具有決定性作用[15,17-18]。

圖2 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝冷卻牛排2DE差異蛋白點標(biāo)記Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) of differentially abundant proteins in HiOx-MAP steak during chilled storage

本研究還檢測出了兩種熱休克蛋白，熱休克蛋白是細胞內(nèi)最重要的伴侶蛋白，可以在蛋白質(zhì)水解過程中使破損的蛋白重定向，并可以保護、維持并修復(fù)細胞內(nèi)一些重要蛋白質(zhì)分子的功能性構(gòu)象，還能調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性及激酶活性，具有抗氧化損傷和抗細胞凋亡的保護作用[19]；DJ-1蛋白則是另一種對氧化還原敏感的伴侶蛋白，可保護神經(jīng)元免于氧化應(yīng)激和細胞死亡[20]。此外，檢測到的抗氧化蛋白2則是一種在生物體內(nèi)普遍存在的抗氧化酶，它們可以通過硫氧還蛋白對體內(nèi)代謝產(chǎn)生的氧化物或超氧化物進行還原，清除氧自由基，因而具有抗氧化的生理作用[21]。以上這些蛋白的表達量發(fā)生顯著變化，尤其是抗氧化蛋白2、DJ-1蛋白（點3101）和熱休克蛋白的表達量在貯藏后期出現(xiàn)上調(diào)，其原因可能是高氧環(huán)境誘發(fā)了牛排的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過激發(fā)機體自身的抗氧化系統(tǒng)來抵御氧化應(yīng)激所帶來的損傷，進而起到減緩肌紅蛋白氧化的作用。

表2 貯藏期間高氧氣調(diào)包裝冷卻牛排的差異蛋白質(zhì)信息Table2 Identi fi ed differentially expressed proteins in HiOx-MAP steak during chilled storage

2.4 高氧氣調(diào)包裝牛排貯藏期間與肉色相關(guān)的潛在蛋白質(zhì)生物標(biāo)簽

表3 高氧氣調(diào)包裝冷卻牛排貯藏期間差異蛋白質(zhì)表達量與肉色指標(biāo)的相關(guān)性Table3 Correlations between differentially abundant proteins in HiOx-MAP chilled steak and different meat color traits

如表3所示，貯藏過程中有15 個差異蛋白與高氧氣調(diào)包裝牛排肉色指標(biāo)密切相關(guān)，這些蛋白主要是一些代謝酶類、伴侶蛋白、抗氧化蛋白以及肌紅蛋白。其中丙酮酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、熱休克蛋白、肌紅蛋白都與常規(guī)肉色指標(biāo)a*值或色彩飽和度有顯著的相關(guān)性，是反映牛排肉色穩(wěn)定性變化的重要潛在蛋白質(zhì)生物標(biāo)簽。作為糖酵解過程中最后一個酶也是主要的限速酶之一[22]，丙酮酸激酶的表達量與a*值和色彩飽和度值呈正相關(guān)性，且丙酮酸激酶（4422）與二者顯著相關(guān)。3-磷酸甘油醛脫氫酶的表達量與a*值、MRA、OCR都呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與高鐵肌紅蛋白相對含量則呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），這種酶也是參與糖酵解進程的關(guān)鍵酶，它通過催化3-磷酸甘油醛的氧化磷酸化來影響糖酵解代謝速率，并調(diào)控著NADH的生成[23]。NADH對于高鐵肌紅蛋白的還原必不可少，高鐵肌紅蛋白還原酶通過NADH傳遞電子給高鐵肌紅蛋白，使得高鐵肌紅蛋白中的三價鐵離子還原成二價鐵離子[13]。此外，肌紅蛋白的表達量與a*值、MRA、OCR呈顯著或極顯著正相關(guān)，Wu Wei等[6]在研究托盤包裝牛排肉色相關(guān)蛋白變化時也有類似報道。Canto等[15]發(fā)現(xiàn)相較于肉色穩(wěn)定性差的牛排，肌紅蛋白表達量在肉色更穩(wěn)定的牛排中得到上調(diào)，并指出透氧托盤包裝貯藏過程中肌紅蛋白的降解可能會導(dǎo)致其表達量下調(diào)，進而降低了肉色穩(wěn)定性。因此，高氧氣調(diào)包裝貯藏過程中，肉色穩(wěn)定性的降低可能與肌紅蛋白的表達量下調(diào)有關(guān)。熱休克蛋白表達量與a*值和色彩飽和度值顯著或極顯著負相關(guān)，與MRA、OCR極顯著正相關(guān)，牛排在貯藏后期出現(xiàn)的熱休克蛋白表達量上調(diào)現(xiàn)象（表2），可能是機體通過熱休克蛋白來抵御氧化損傷的結(jié)果。

研究還發(fā)現(xiàn)，在代謝酶中，果糖-二磷酸醛縮酶、果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2、黃素還原酶、蘋果酸脫氫酶以及14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶與牛排的MRA和OCR呈顯著的正相關(guān)性（P＜0.01）。其中果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2可催化果糖-1,6-二磷酸水解生成果糖-6-磷酸和磷酸，而果糖-1,6-二磷酸則是糖酵解過程中的重要中間反應(yīng)物[24]。果糖-二磷酸醛縮酶可以催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間發(fā)生可逆的羥醛裂解反應(yīng)，也是參與糖酵解的重要酶類，牛肉成熟過程中果糖-二磷酸醛縮酶B的表達量下調(diào)已被其他學(xué)者證明[25]。鑒于糖酵解是NADH生成的重要途徑，貯藏期間果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2和果糖-二磷酸醛縮酶的表達量下調(diào)可能導(dǎo)致了肉中NADH的減少，從而降低了牛排的MRA，使牛排的肉色穩(wěn)定性不斷降低。蘋果酸脫氫酶和黃素還原酶則分別是三羧酸循環(huán)中調(diào)控NADH和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinarnide adenine dinucleotide，NADPH）生成的關(guān)鍵酶，NADH和NADPH都對維持肉色穩(wěn)定性至關(guān)重要[26]。另外，NADH作為線粒體電子傳遞鏈中的重要反應(yīng)物與再生產(chǎn)物，其含量和氧氣攝入量顯著相關(guān)，較低的NADH含量會降低牛排的OCR[27]。目前關(guān)于14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶影響肉色的機理還尚不明確，但Joseph等[8]曾報道這種酶的表達量在肉色穩(wěn)定的西冷部位要顯著高于其在肉色不穩(wěn)定的里脊部位的表達量，說明14 kDa磷酸組氨酸磷酸酶的表達量下調(diào)不利于維持肉色穩(wěn)定。研究表明氧化環(huán)境導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化會造成一些酶原有功能的喪失，并降低其活性，另外，蛋白質(zhì)在氧化過程中所發(fā)生的結(jié)構(gòu)改變會使其變得更易被降解[28]；因此貯藏過程中高氧氣調(diào)包裝可能會降低牛排中這些參與糖酵解和三羧酸循環(huán)的代謝酶的表達量，進而降低NADH和NADPH的生成量，引發(fā)牛排的MRA和OCR快速下降，肉色穩(wěn)定性也隨之降低。

貯藏期間，抗氧化蛋白2的表達量與高鐵肌紅蛋白相對含量呈顯著正相關(guān)性，與MRA和OCR則顯著負相關(guān)（P＜0.01），暗示著高氧氣調(diào)包裝可能會激發(fā)抗氧化蛋白2的表達量上調(diào)以達到保護機體免受氧化損傷的目的，從而緩解肌紅蛋白的氧化。DJ-1蛋白在細胞抵御氧化應(yīng)激的反應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[29]，Wu Wei等[30]發(fā)現(xiàn)貯藏中牛排的a*值、MRA與DJ-1蛋白表達量呈顯著的負相關(guān)性，并指出DJ-1蛋白可以作為指示貯藏后期肉品顏色變化的重要生物標(biāo)簽。本實驗結(jié)果顯示，不同DJ-1蛋白亞型（點5117和點3101）的表達量與各肉色指標(biāo)呈現(xiàn)出相反的相關(guān)性，其中點3101與高鐵肌紅蛋白相對含量、MRA和OCR之間表現(xiàn)出類似于抗氧化蛋白2的相關(guān)性，點5117則與高鐵肌紅蛋白相對含量呈極顯著負相關(guān)，與MRA和OCR極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。有研究指出當(dāng)肉品處于惡劣的貯藏環(huán)境中時，會促使DJ-1蛋白的表達量上調(diào)，但DJ-1蛋白會也在對抗氧化損傷的過程中不斷被消耗[20,29,31]。因此推測對于高氧氣調(diào)包裝牛排，DJ-1蛋白的表達量可能會隨時間延長出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其變化趨勢出現(xiàn)拐點的時間則由這種蛋白表達量的上調(diào)程度和自身被消耗的程度共同決定，這導(dǎo)致了不同DJ-1蛋白亞型的表達量與肉色指標(biāo)的相關(guān)性并不一致。

3 結(jié) 論

貯藏過程中，高氧氣調(diào)包裝牛排的MRA和OCR隨貯藏時間延長而快速下降，這導(dǎo)致了牛排的a*值和色彩飽和度貯藏5 d后顯著降低，高鐵肌紅蛋白相對含量顯著升高，牛排的肉色穩(wěn)定性不斷降低。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及差異蛋白與各肉色指標(biāo)之間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)一些參與糖酵解和能量代謝的酶類、抗氧化蛋白、氧化應(yīng)激相關(guān)的伴侶蛋白以及肌紅蛋白是涉及高氧氣調(diào)包裝牛排肉色穩(wěn)定性變化的重要因素，可作為研究肉品褐變失色現(xiàn)象的潛在生物標(biāo)簽。其中丙酮酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、果糖-二磷酸醛縮酶和果糖-1,6-二磷酸酶同工酶2通過調(diào)節(jié)糖酵解進程來影響NADH的產(chǎn)生，而蘋果酸脫氫酶和黃素還原酶則通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)來影響NADH和NADPH的產(chǎn)生，貯藏期間這些酶表達量的下調(diào)可能減少了NADH和NADPH的產(chǎn)生，進而降低了牛排的MRA和OCR。還發(fā)現(xiàn)高氧氣調(diào)包裝貯藏過程中，肉色穩(wěn)定性的降低可能也與肌紅蛋白的表達量下調(diào)有關(guān)。另外，抗氧化蛋白2、熱休克蛋白以及DJ-1蛋白的表達量也與肉色指標(biāo)密切相關(guān)，高氧環(huán)境可能會引起肉品的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而促使這些蛋白表達量出現(xiàn)上調(diào)來保護機體免受氧化損傷，進而減緩肌紅蛋白的氧化。綜上所述，本研究所發(fā)現(xiàn)的蛋白標(biāo)簽可以從機理上為解釋高氧氣調(diào)包裝肉品的肉色變化提供有意義的理論依據(jù)。