2D-HPLC-QTOF法對注射用鹽酸表柔比星中二聚體的鑒定

邵伍軍 和燕玲,* 金美春 陳延安 陳逢灶

(1 浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺州 318000；2 臺州學院，臺州 318000)

鹽酸表柔比星屬于廣譜抗腫瘤抗生素，是乳腺惡性腫瘤化療的一線用藥，收載于多個國家藥典[1-4]。表柔比星中的已知雜質(zhì)有多柔比星、雙氫柔紅霉素、多柔比星酮、柔紅霉素(起始原料)、4'-鹽酸表柔紅霉素(中間體)、柔紅霉素酮和三氟乙酰柔紅霉素(中間體)等[5-6]，目前對注射用鹽酸表柔比星中雜質(zhì)檢測主要采用HPLC法。注射用鹽酸表柔比星在長期穩(wěn)定性留樣檢測中會出現(xiàn)一個未知峰，由于注射用鹽酸表柔比星現(xiàn)有HPLC檢測方法流動相中含有磷酸和十二烷基硫酸鈉緩沖鹽，不適合LC-MS直接分析，且由于離子對試劑的影響及該雜質(zhì)不穩(wěn)定，對此雜質(zhì)峰很難進行制備定性測定。本文采用新建的在線二維液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法對該磷酸及十二烷基硫酸鈉緩沖鹽系統(tǒng)中注射用鹽酸表柔比星的未知雜質(zhì)峰進行了定性分析，鑒定該未知雜質(zhì)為鹽酸表柔比星二聚體。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

Agilent 1260型HPLC，Agilent 6540型LCQTOF。乙腈、甲醇均為市售色譜純；甲酸為市售質(zhì)譜純；其余試劑均為分析純。水為Milli-Q超純水。

注射用鹽酸表柔比星(浙江海正藥業(yè)公司生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

1.2.1 一維色譜條件

色譜柱：Venusil ASB C18(250mm×4.6mm,5μm)，Agela ；波長：254nm；流速：2.0mL/min；柱溫：35℃；流動相：乙腈-水-甲醇-85%磷酸溶液(290:540:170:1,V/V/V/V)并含0.2%十二烷基硫酸鈉的混合溶液。

1.2.2 二維色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18, 2.1mm×50mm,1.8um；波長：254nm；流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；流動相：0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液(70:30)。

1.2.3 質(zhì)譜條件

ESI源；正離子模式；干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：8L/min；霧化氣壓力：35psig；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min；毛細管電壓：3500V；采集模式：MS及Targeted MS/MS。

1.2.4 操作步驟

取注射用鹽酸表柔比星適量，加一維液相的流動相制成約含100μg/mL鹽酸表柔比星的溶液，取50μL注入一維液相色譜儀，通過一維紫外檢測色譜圖確定各雜質(zhì)的出峰位置，分別對主峰和未知雜質(zhì)進行中心切割，通過在液相色譜方法中設(shè)置閥切換時間，將雜質(zhì)收集于定量環(huán)中，再通過閥切換將雜質(zhì)從定量環(huán)中反沖至二維色譜柱上分離并脫鹽，最后進入質(zhì)譜進行分析。四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀采用Targeted MS/MS的采集模式，同時得到一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜。使用軟件通過精確相對分子質(zhì)量和同位素分布進行元素組成分析，確定分子式，結(jié)合表柔比星二級質(zhì)譜碎片和該未知雜質(zhì)二級質(zhì)譜碎片推導(dǎo)該雜質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 注射用鹽酸表柔比星主峰二維在線脫鹽結(jié)構(gòu)確認

取樣品溶液，按“1.2”項下實驗條件及操作步驟測定，一維液相中主峰保留時間在10.2min，切換到二維液相中后，紫外中主峰保留時間17.2min，總離子流中保留時間17.3min，質(zhì)譜信號[M+H]+質(zhì)荷比為544.1814，鹽酸表柔比星主峰一維、二位液相圖及總離子流色譜圖見圖1。表柔比星二級質(zhì)譜圖及碎片離子歸屬見圖2。

2.2 注射用鹽酸表柔比星樣品中未知雜質(zhì)峰結(jié)構(gòu)推測

圖1 注射用鹽酸表柔比星主峰一維液相色譜圖，二維液相色譜圖及離子流色譜(TIC)圖Fig. 1 The first dimensional HPLC-UV chromatogram, the dimensional HPLC-UV chromatogram and The TIC spectrums of epirubicin hydrochloride for injection

取樣品溶液，按“1.2”項下實驗條件及操作步驟測定，一維液相中未知雜質(zhì)峰保留時間18.4min，切換到二維液相中后，紫外中主峰保留時間26.1min，總離子流中保留時間26.2min，質(zhì)譜信號[M+H]+質(zhì)荷比為1087.3539，未知雜質(zhì)一維、二位液相及總離子流色譜圖見圖3。未知雜質(zhì)二級質(zhì)譜圖見圖4，碎片離子歸屬見表1，m/z570以下的碎片峰與表柔比星一致。Dinesh等[7]、聞宏亮等[8]和王穎等[9]均對不同來源的表柔比星二聚體進行過MS分析，其質(zhì)譜圖的差異提示表柔比星二聚體并非為單一結(jié)構(gòu)。本研究中借助軟件推測的分子式及表柔比星二級質(zhì)譜圖與未知雜質(zhì)二級質(zhì)譜圖進行對比推測，確定此未知雜質(zhì)為表柔比星二聚體，與EP 9.0中雜質(zhì)G結(jié)構(gòu)一致[10]。表柔比星二聚體具體結(jié)構(gòu)見圖5

圖2 注射用鹽酸表柔比星二級質(zhì)譜圖及二級碎片離子歸屬Fig. 2 The MS2 spectrum and the proposed structures of the epirubicin hydrochloride for injection

3 結(jié)論

圖3 未知雜質(zhì)一維液相色譜圖，二維液相色譜圖及質(zhì)譜總離子流圖Fig. 3 The first dimensional HPLC-UV chromatogram, the dimensional HPLC-UV chromatogram and the TIC spectrums of unknown impurity

圖4 未知雜質(zhì)二級質(zhì)譜圖Fig. 4 The MS2 spectrum of unknown impurity

圖5 推測注射用鹽酸表柔比星二聚體結(jié)構(gòu)Fig. 5 The structure of dimer in epirubicin hydrochloride for injection

本研究采用在線二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對注射用鹽酸表柔比星的未知雜質(zhì)進行分析，方法簡便、靈敏，有效地解決了流動相中含不揮發(fā)性磷酸鹽及十二烷基硫酸鈉緩沖鹽色譜系統(tǒng)不適合用LC-MS快速鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的難題。