夾脊電針對急性脊髓損傷模型大鼠NLRP3炎癥小體活化的實驗研究*

李曉寧，李慶琳，付 豪，梅繼林

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

急性脊髓損傷(Acute spinal cord injury，ASCI)多由暴力外傷所致，其病理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[1]。原發(fā)性損傷因難以控制，因此聚焦于如何對SCI繼發(fā)性損傷進行干預并促進神經(jīng)功能修復。繼發(fā)性損傷機制眾多，而細胞焦亡作為一種細胞新型程序性死亡，激起了國內(nèi)外學者討論和廣泛研究。研究成果顯示多種神經(jīng)疾病均有NLRP3過度活化而引起的細胞焦亡參與[2]，那么此機制在急性脊髓繼發(fā)性損傷中是否也存在呢?基于此，筆者以ASCI大鼠為對象，通過對比不同模型下炎性因子NLRP3、ASC、cleaved caspase-1的表達情況，對細胞焦亡機制進行探索，同時為臨床夾脊電針治療急性脊髓損傷提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

由遼寧長生生物技術有限公司(許可證號2015-0001)提供的36只清潔級雌性大鼠，體質(zhì)量為210～230g,實驗過程中食物充足，飲水自由，室內(nèi)溫度控制在24℃～26℃，光照12 h晝夜循環(huán)，均按照動物關懷指南嚴格執(zhí)行。

1.2 實驗儀器

石蠟切片機(德國Leica，RM2235);電熱恒溫鼓風干燥箱(中國上海精宏，QH01-9030A);超純水系統(tǒng)(中國香港Heal Force，NW10LVF型);顯微鏡(日本OLUMPUS，DP73);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特，DH36001B);電針儀(中國英迪，KWD-808 II)。

1.3 實驗試劑

過氧化氫(中國國藥，10011218);無水乙醇(中國國藥，10009218)；蘇木精(中國Solarbio，H8070);山羊血清(中國Solarbio，SL038);DAB顯色液(中國Solarbio，DA1010)；NLRP3(中國Wanleibio，WL02635);cleaved caspase-1(中國Wanleibio，WL03450)；生物素化山羊抗兔IgG(中國Beyotime，A0277);辣根酶標記鏈酶親合素(中國Beyotime，A0303)；ASC(中國Bioss，bs-6741R)。

2 實驗方法

2.1 動物分組與模型制備

將36只大鼠隨機均分成假手術組(Sham)、模型組(Model)和夾脊電針組(EA)，每組根據(jù)術后3、7天時間點又分為2個亞組，對每只大鼠編號并進行標記。

使用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)注射大鼠腹腔進行麻醉。首先使大鼠俯臥將其固定，減去背部毛發(fā)以及常規(guī)消毒，根據(jù)大鼠肋骨體表標志確定第10胸椎位置。在第10胸椎處作長約3 cm的縱行手術切口，切開皮下肌筋膜，暴露9～11胸椎棘突，鈍性分離附近肌肉至關節(jié)突水平，暴露其下的椎板，直至完整暴露脊髓組織。將10 cm玻璃管垂直立于暴露的脊髓組織，釋放5 g的砝碼，將其沿玻璃管自由落下，造成脊髓組織的局部損傷，操作完成后，用生理鹽水沖洗局部并觀察脊髓充血情況，最后縫合傷口。

2.2 造模成功標志

當砝碼撞擊脊髓時，可見大鼠肢體及軀干異常活動，雙側下肢痙攣回縮，移除砝碼后可見暴露部位硬脊膜充血變紅[3-4]。觀察動物運動過程中各關節(jié)及軀體協(xié)調(diào)情況進行BBB評分，評分范圍為0～21分，0分為無后肢運動，滿分為21分為步態(tài)協(xié)調(diào)，軀干穩(wěn)定，運動狀態(tài)良好，0～7分主要觀察后肢的活動情況。選取BBB評分為1～3分的大鼠入組，表現(xiàn)為大鼠后肢有1～2個關節(jié)可廣泛活動[5]。

2.3 各組實驗模型干預方法

假手術組在暴露脊髓后，回籠飼養(yǎng)，不采取任何處置，每日同步固定30 min；模型組大鼠在模型制備后每日同步固定30 min；夾脊電針組[6]干預方法為選用0.35 mm×13 mm規(guī)格的毫針對大鼠進行針刺，根據(jù)脊髓損傷位置選取針刺雙側T9、T11節(jié)段夾脊穴；針刺深度為4～5 mm；針刺后以脊柱同側夾脊穴為一組連接電針儀，正極在上、負極在下；強度以大鼠可耐受且背部肌肉輕微抽動為宜(約為0.4～0.6 mA)，時長30 min，日1次。

2.4 實驗樣本采集

根據(jù)大鼠活動能力，評分范圍為0～21分，分數(shù)越高自主活動能力越強。各組大鼠于術后3天和7天時分別觀察并記錄BBB評分。

在治療后3、7天時用水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉大鼠并處死，快速取出損傷處長度約2 cm的脊髓，置于4%多聚甲醛緩沖液中固定并保存，包埋切片，將標本蠟塊裝在切片機上，切成層厚為5 μm的薄片。烘干后，依次放入不同濃度的二甲苯和無水乙醇中反復浸泡，使切片脫蠟并通過3% H2O2以室溫進行孵育和正常山羊血清封閉15 min；3種試劑一抗用PBS按1∶100比例稀釋后二抗用PBS稀釋200倍，孵育30 min，浸泡在PBS中5 min，重復3次。滴加100 μL的DBA顯色試劑稀釋后用蘇木素復染，封片并以400×顯微鏡下拍照。

于術后各治療時間點結束后取出其損傷處脊髓，以IHC法檢測Nod樣受體蛋白3 (NLR family pyrindomain-containing3,NLRP3)、凋亡相關的斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containinga CARD,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cleaved caspase-1)蛋白表達。

2.5 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 各組大鼠治療前后BBB評分的變化

Sham組大鼠術后BBB評分無明顯變化。與Sham組相比，Model組大鼠術后各時間點BBB評分明顯下降(P<0.05)。與Model組相比，EA組大鼠術后3、7天BBB評分顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BBB評分結果

3.2 各組大鼠脊髓組織中NLRP3表達

Model組大鼠脊髓組織術后各時間點NLRP3陽性細胞平均光密度值均高于Sham組(P<0.05)。給予夾脊電針治療后，EA組大鼠脊髓組織NLRP3陽性細胞平均光密度值在各時間點均低于Model組(P<0.05)。見封三彩圖1、圖2。

3.3 各組大鼠脊髓組織中ASC表達

模型組大鼠脊髓組織術后各時間點ASC陽性細胞平均光密度值高于Sham組(P<0.05)。EA組大鼠脊髓組織ASC陽性細胞平均光密度值下降且顯著低于Model組(P<0.05)。見封三彩圖3、圖4。

3.4 各組大鼠脊髓組織cleaved caspase-1表達情況

模型組大鼠脊髓組織術后cleaved caspase-1陽性細胞平均光密度值顯著高于Sham組(P<0.05)。給予夾脊電針治療后，EA組大鼠脊髓組織cleaved caspase-1陽性細胞平均光密度值低于Model組(P<0.05)。見封三彩圖5、圖6。

注：與Sham組比較,#P<0.05；與Model組比較,*P<0.05。

注：與Sham組比較,#P<0.05；與Model組比較,*P<0.05。

4 討論

細胞焦亡作為一種新型程序性死亡方式，其經(jīng)典焦亡途徑由Caspase-1裂解相關蛋白促使細胞膜穿孔細胞內(nèi)容物外溢，細胞最終死亡[7]；同時Caspase-1還可以激活白細胞介素-1β(IL-1β)前體形成IL-1β，使炎癥反應不斷擴大，加重繼發(fā)性損傷[8]。炎癥小體在整個細胞焦亡信號通路中承接上游信號分子，再通過活化的Caspase-1傳遞焦亡信號至下游蛋白，最終細胞破裂并釋放IL-1β和白細胞介素-18(IL-18)，使細胞焦亡整個過程最終完成。

炎癥小體NLRP3 一般通過兩類復合體激活機體免疫應答，分別是NLR家族和ALR家族[9]。而本次實驗涉及的NLR家族，是由NLRP3、ASC 和Caspase-1 前體組成的一種大分子多蛋白復合體。研究表明，針對NLRP3炎癥小體活化的調(diào)控機制可能包括NLRP3 priming 階段、蛋白復合物組裝及亞細胞器等方面的調(diào)節(jié)[10]。NLRP3接受活化信號后，細胞內(nèi)離子環(huán)境發(fā)生變化，鈣離子、鉀離子依賴于各自的離子通道而發(fā)生變化。鈣離子升高，鉀離子濃度不斷降低并外流，現(xiàn)公認激活NLRP3必須通過降低鉀離子濃度而實現(xiàn)[11]。炎癥反應發(fā)生時NLRP3 與ASC 結合，同時Caspase-1 前體與其共同組裝NLRP3 炎癥小體，被活化的Caspase-1 最終誘導細胞焦亡。

除了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，同時NLRP3也與糖尿病、動脈粥樣硬化、痛風等疾病的發(fā)展密切相關[12]。本次實驗可證實在急性脊髓損傷中，NLRP3炎性小體同樣參與急性脊髓損傷后炎性反應。Kim MJ[13]以及Rivero Vaccari JP[14]證明NLRP3炎性體介導了脊髓損傷后一系列炎癥反應以及Jiang W[15]的研究皆表明NLRP3炎性小體是脊髓損傷繼發(fā)性損害的重要因素。還有學者提出經(jīng)典焦亡途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起主導作用，并提議針對該靶點進行干預[16]。

在中醫(yī)學中本病屬“痿病”范疇。督脈為陽脈之海，通調(diào)一身陽氣，激發(fā)太陽、陽明、少陽經(jīng)氣，氣血充盛，肢體得以濡潤。況且在病位附近部位及其經(jīng)脈取穴，發(fā)揮了腧穴的近治作用，使治療目的更加明確。所以取夾脊穴對于全身運行氣血，調(diào)和陰陽，可通經(jīng)氣使之上下貫通，陽氣通達，刺激肢體運動具有重要意義。據(jù)解剖學研究發(fā)現(xiàn)[17]，脊神經(jīng)后內(nèi)側支分布在人體后正中線旁開0.5寸深部椎板表面，直刺夾脊穴可改善脊柱深層肌肉的痙攣狀態(tài)，并通過其周圍的脊神經(jīng)根,向中樞系統(tǒng)進行信息反饋從而促進中樞系統(tǒng)相關支配區(qū)域的功能恢復，同時給予低頻直流電傳導神經(jīng)沖動，促進神經(jīng)突觸可塑性。本次動物實驗針刺穴位定位在損傷脊髓節(jié)段上下椎體棘突旁夾脊穴，是根據(jù)“電場”理論，損傷處適宜電場電流方向可減輕軸突損傷，并促進神經(jīng)新生，保護神經(jīng)元[18]。而通過既往研究可發(fā)現(xiàn)電針可通過清除自由基、提高組織抗氧化能力和缺氧缺血狀態(tài)而改善微環(huán)境；同時抑制神經(jīng)細胞凋亡促進脊髓神經(jīng)恢復[19-21]。

本次實驗以機械砸壓的方式造成大鼠脊髓局部充血損傷，使大鼠肢體運動功能受損視為造模有效，最終選取BBB評分3分以下進行入組。模型組運動功能評分下降而炎性指標均顯著升高，而夾脊電針治療后3天及7天各項觀察指標均向良性方向改善，且在7天的時間點各項均高于3天，雖然由于樣本有限而無顯著差距，但有著良好的趨向性，可能療效與治療天數(shù)之間具有量效關系，但還需要進一步研究。課題組在之前的實驗中證實了夾脊電針對于急性脊髓損傷組織微環(huán)境Rho-ROCKⅡ信號通路以及細胞凋亡的抑制作用，本次實驗補充其不足并從炎性反應方面進行觀察，更加全面地驗證夾脊電針對于急性脊髓損傷的作用機制。

結果顯示，夾脊電針治療能提高脊髓損傷大鼠模型BBB評分且降低NLRP3、ASC和Caspase-1表達，防止炎性小體過度活化，減緩細胞焦亡，改善脊髓繼發(fā)性炎性損傷，最終實現(xiàn)大鼠肢體活動能力增強，為脊髓損傷不斷發(fā)掘新的致病機制以及為臨床夾脊電針治療脊髓損傷提供實驗依據(jù)。