于學(xué)平，匡炳霖，戴曉紅，鄒 偉△，滕 偉，于薇薇，馬慧慧，陳秋欣，劉 鵬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱第九中學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(ICH)指非外傷性腦實(shí)質(zhì)出血[1]，具有發(fā)病率和死亡率高、預(yù)后差、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，是威脅人類生命健康和生活質(zhì)量的重大疾病[2]，至今尚缺乏真正有效的治療方法和藥物。隨著對腦出血后腦損傷機(jī)制研究的日益深入，ICH后神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)大量壞死被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)功能受損的主要因素，Wnt通路被證實(shí)是維持細(xì)胞增殖分化的主要通路之一，而通路中的糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是抑制該通路的重要因子，其失活被認(rèn)為是神經(jīng)元存活機(jī)制之一[3]。當(dāng)ICH發(fā)生后，GSK-3β對該通路的抑制作用被解除，激活的Wnt通路即可促進(jìn)NSCs增殖分化[4]。針灸作為重要的治療中風(fēng)的手段已在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可[5-6]。針刺在NSCs增殖分化方面起到積極作用，而這一療法能否在ICH大鼠中通過抑制GSK-3β表達(dá)從而激活Wnt通路來促進(jìn)NSCs增殖分化是本研究的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

符合國家二級動物標(biāo)準(zhǔn)的健康清潔級Wistar雄性大鼠192只。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。體質(zhì)量(250±20)g，自由覓食飲水。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)(8±2)天，體質(zhì)量符合(340±30)g的標(biāo)準(zhǔn)后入組，造模前12 h開始禁食，6 h前開始禁水。隨機(jī)分為空白組(A組，n=12)、模型組(B組，n=60)、抑制劑DKK1組(C組，n=60)、針刺組(D組，n=60)。B、C、D組大鼠再按3、7、14、21、28天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成5個(gè)亞組，每個(gè)亞組12只。

1.2 主要儀器與試劑

立體定位儀(成都儀器廠，STW-1);針灸針(華佗牌，0.35×40 mm);牙鉆(上海齒科機(jī)械廠，307-6);一抗(Rabbit-anti-GSK3-β，北京博奧森);二抗(Goat-anti-Rabbit，北京博奧森);核酸擴(kuò)增儀(ABI 9700，美國);凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech公司，美國);垂直電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio Rad公司，美國)。

1.3 ICH模型制作

采用戊巴比妥(60 mg/kg) 腹腔注射麻醉。取俯臥位固定于立體定位儀上。矢狀位切開頭皮，暴露前囟。將微量注射器固定于立體定位儀上，對準(zhǔn)前囟，向右旁開3.5 mm，再向后旁開0.2 mm，在此處做一標(biāo)記，用牙鉆鉆孔，此處正對鼠腦基底節(jié)區(qū)。同時(shí)鼠尾取血，用微量注射器抽取60 μL自體血，在此孔于腦組織表面深6 mm的深度以20 μL/min速度緩慢注血，完畢后3～5 min出針。牙科水泥封閉鉆孔，慶大霉素消毒，縫合傷口。采用Berderson評分法[7]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。將1～3分大鼠視為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 干預(yù)方法

空白組不作處理，直接取材。模型組造模后不作處理；抑制劑DKK1組造模前30 min注射GSK-3β抑制劑DKK1 10 μL(濃度0.1 μg/μL)；針刺組造模后，參照《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》，選取百會穴和曲鬢穴，以0.35×40 mm針灸針快速刺入百會穴帽狀腱膜下，并向右下方曲鬢穴透刺，進(jìn)針深度大約15 mm。以200轉(zhuǎn)/min速度進(jìn)行捻轉(zhuǎn)，每日1次，每次留針30 min，期間捻轉(zhuǎn)刺激2次，每次持續(xù)5 min。不同組大鼠經(jīng)相應(yīng)處理后在各自時(shí)間點(diǎn)取材(A組不分時(shí)間點(diǎn)，直接取材)。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 神經(jīng)系統(tǒng)功能評估 分別在造模后3、7、14、21、28天應(yīng)用Longa評分[8]進(jìn)行神經(jīng)功能評估。

1.5.2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)方法 先制備SDS-PAGE凝膠。取待測組織研磨，再加入蛋白裂解液，接著沸水煮樣品5分，之后冰盒靜置，12 000 r/min下4℃離心10 min，把上清液滴入離心管。測完蛋白含量，用進(jìn)樣器取樣品上樣。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。封閉液中加適當(dāng)濃度一抗4℃過夜，第2天取出復(fù)溫加適當(dāng)濃度二抗。

1.5.3 PCR實(shí)驗(yàn)方法 離心管在冰浴中分別加入PCR緩沖液、dNTP、引物和DNA模板等。將混合液離心后放入PCR擴(kuò)增儀內(nèi)擴(kuò)增。最后PCR電泳檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。神經(jīng)功能評分、免疫印跡和PCR結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析結(jié)合Tukey檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺治療對腦出血大鼠神經(jīng)功能影響

如表1所示，針刺組和抑制劑組從14天開始Longa評分顯著降低，且針刺組與抑制劑組相比明顯降低(P<0.05);針刺組與模型組相比從14天開始評分明顯降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)Longa評分比較

2.2 各組GSK-3β蛋白表達(dá)

空白組GSK-3β表達(dá)最高；模型組總體比空白組低，其中7天最低，而后逐漸升高；另兩組GSK-3β表達(dá)在14天最低，而后逐漸上升。抑制劑組3、14、21、28天與同時(shí)間模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。針刺組14天與同時(shí)間模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注:M.模型組,D.抑制劑組,Z.針刺組;與M比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.3 各組GSK-3βmRNA PCR結(jié)果

GSK-3βmRNA空白組最高。模型組、抑制劑組和針刺組14天表達(dá)最低，而后總體呈上升趨勢。抑制劑組3、7、21天與同時(shí)間模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。針刺組3、7、14天與同時(shí)間模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注:M.模型組,D.抑制劑組,Z.針刺組;與M比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

“百會”透“曲鬢”針刺法是鄒偉教授多年治療腦出血的臨床經(jīng)驗(yàn)?！鞍贂蓖浮扒W”可以貫穿督脈、足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)，具有統(tǒng)調(diào)一身之陽氣的功能，并且可以達(dá)到一針橫貫額、頂、顳3區(qū)的效果[9]，對ICH大鼠運(yùn)動功能、感覺功能和意識的恢復(fù)方面均有很大幫助[10]。本研究中采取Longa神經(jīng)功能評分法驗(yàn)證其改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損程度，結(jié)果顯示,針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損降低，神經(jīng)功能有明顯恢復(fù)，與模型組比較針刺組療效優(yōu)于模型組?？梢姟鞍贂蓖浮扒W”針刺法對腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損具有明顯的治療作用。

近年研究發(fā)現(xiàn)，針刺在促進(jìn)NSCs增殖分化方面有很大優(yōu)勢[11]，動物的大腦皮層分別與腦組織內(nèi)不同神經(jīng)功能分區(qū)相對應(yīng)，針刺大腦皮層的不同神經(jīng)功能區(qū)，就可刺激其對應(yīng)腦組織NSCs的增殖分化[12]。GSK-3β是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶[13]。正常情況下，它在成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞高表達(dá)，而且以Axin-Apc-GSK-3β復(fù)合物形式促進(jìn)下游β-catenin磷酸化。β-catenin未被磷酸化時(shí)，可結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)的TCF/LEF，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，但β-catenin被磷酸化后，這一過程即被終止。近些年研究發(fā)現(xiàn),GSK-3β在調(diào)節(jié)Wnt通路方面發(fā)揮重要作用。Wnt因子是上世紀(jì)末在研究癌基因時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的[14]，已經(jīng)證實(shí)Wnt信號通路廣泛參與多種血管疾病的發(fā)生[15]。當(dāng)ICH等因素刺激下，Wnt基因大量編碼Wnt蛋白并釋放入細(xì)胞質(zhì)，該蛋白首先會激活Dsh，激活的Dsh可抑制Axin-Apc-GSK-3β復(fù)合物形成，從而抑制β-catenin磷酸化[16]，繼而促進(jìn)NSCs增殖分化，因此形成Wnt-GSK-3β-β-catenin通路。但單純在ICH應(yīng)激下激活Wnt通路來促進(jìn)NSCs增殖分化，其水平畢竟是有限的，如何更大程度激活Wnt通路從而促進(jìn)NSCs增殖分化已成為研究熱點(diǎn)。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，空白組GSK-3β表達(dá)最高；模型組總體比空白組低，其中7天最低，而后逐漸升高，針刺組和抑制劑組的GSK-3β表達(dá)在14天最低，而后逐漸上升。抑制劑組3、14、21、28天與同時(shí)間模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。針刺組14天與同時(shí)間模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示針刺可能通過抑制GSK-3β表達(dá)、激活Wnt通路的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)NSCs從增殖轉(zhuǎn)入分化狀態(tài)的細(xì)胞的數(shù)量和規(guī)模。

綜上，我們推斷針刺“百會”透“曲鬢”治療腦出血可能的作用機(jī)制之一可能通過抑制GSK-3β表達(dá)來激活Wnt通路，繼而促進(jìn)NSCs增殖分化，從而促進(jìn)ICH大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究證明,針刺可能以GSK-3β為靶點(diǎn)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而達(dá)到針刺治療急性腦出血作用，進(jìn)一步豐富了針刺治療腦出血的作用機(jī)制。