熊琳 何曉琴 范黎 徐細明
[摘要] 目的 探討MK-2206作用于肝癌細胞huh7后對其生物學(xué)行為的影響及作用機制。 方法 體外培養(yǎng)人肝癌細胞系huh7,采用不同濃度(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)MK-2206干預(yù)huh7細胞。采用CCK-8檢測細胞增殖變化;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化;蛋白免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達。 結(jié)果 與對照組(0 μmol/L)比較,MK-2206對肝癌細胞huh7的增殖活性有明顯抑制作用,且呈劑量依賴性和時間依賴性(P < 0.05);MK-2206誘導(dǎo)huh7細胞凋亡(P < 0.05),顯著抑制Akt的蛋白表達(P < 0.05)。 結(jié)論 Akt抑制劑MK-2206可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來調(diào)控肝癌細胞huh7的生物學(xué)行為。
[關(guān)鍵詞] 肝癌;PI3K/Akt信號通路;MK-2206;增殖;遷移;凋亡
[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210(2019)01(a)-0008-05
肝癌是世界第六大常見癌癥,也是發(fā)生癌癥相關(guān)死亡的第三大原因,近年來其發(fā)病率及死亡率仍呈上升趨勢[1]。我國肝癌患者人數(shù)占全世界肝癌患者的55%[2]。手術(shù)切除是肝癌的首選治療方法,但肝癌發(fā)病隱匿,惡性程度高,進展速度快,根治性手術(shù)僅可用于不足30%的患者[3]。因此,系統(tǒng)性治療在中晚期肝癌患者的治療中扮演著重要角色。傳統(tǒng)的化療方法副作用大,療效不佳,易耐藥[4]。分子靶向藥物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期,但其僅可延長總體生存期數(shù)月[5-6]。目前,迫切需要開發(fā)出新的靶向治療藥物。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要靶點,該通路在調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及自噬等方面中具有重要作用[7],有望成為新的惡性腫瘤治療靶點。MK-2206是一種人工合成的Akt特異性變構(gòu)抑制劑,可有效抑制多種惡性腫瘤細胞增殖,促進細胞凋亡,具有良好的抗腫瘤活性[8-9]。本研究以肝癌細胞huh7為研究對象,探討MK-2206的抗肝癌作用及其可能的作用機制,以期為其抗腫瘤研究和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 儀器與試藥
1.1.1 儀器? 超凈工作臺(美國AIRTECH);CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Binder);普通及倒置顯微鏡(日本Olympus);離心機(德國Thermo);流式細胞儀(美國Bio-Rad);酶標(biāo)儀(美國PerKin Elmer);超低溫冰箱(New Brunswick Scientific)、電熱恒溫干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司);SDS-PAGE電泳(北京六一生物科技有限公司);Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR)等。
1.1.2 試劑? DMEM(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司);青鏈霉素(美國Hyclone);胰蛋白酶-EDTA(美國Hyclone);胰蛋白酶(美國Hyclone),MK-2206(selleck公司);CCK-8試劑(日本Dojindo);細胞凋亡試劑盒(美國Bio-rad);BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma);蛋白上樣緩沖液(日本Takara);蛋白Marker(日本Takara);蛋白抗體(美國Abcam)等。
1.1.3 細胞系? 人肝癌細胞huh7細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫。
1.2 方法
1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代? 將huh7細胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng),每2 d為細胞更換培養(yǎng)液1次。于顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài),待細胞生長到覆蓋瓶底70%~80%面積時,可進行傳代接種。棄瓶內(nèi)的培養(yǎng)基,用1 mL胰酶均勻覆蓋瓶底,在培養(yǎng)箱孵育1~2 min,待細胞收縮變圓,用培養(yǎng)基終止消化,離心,棄上清,按1∶3傳代,用于后續(xù)實驗。
1.2.2 CCK-8細胞生長抑制率檢測? 取對數(shù)生長期的huh7細胞,0.5%胰酶消化1 min后,RT 1000 g/min離心5 min,重懸培養(yǎng)基,調(diào)整細胞濃度為5×105/mL,接種于3塊96孔板,每孔加入上述細胞懸液100 μL。待細胞貼壁后加入MK-2206,使藥物終濃度分別為2.5、5、10、20和40 μmol/L,每種濃度組以及陰性對照組均設(shè)5個復(fù)孔。分別在加藥后24、48、72 h后加入CCK-8(10 mg/mL)10 μL,于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min~1 h,以490 nm為檢測波長,用酶標(biāo)儀讀取吸光度,取5個復(fù)孔的平均值。上述實驗重復(fù)3次。抑制率=1-(OD加藥孔-OD調(diào)零孔)/(OD對照孔-OD調(diào)零孔)。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率? 收集不同藥物濃度(0、2.5、5、10、20和40 μmol/L)處理24 h后的huh7細胞,收集原培養(yǎng)基,用0.5%不含EDTA的胰蛋白酶0.5 mL消化各孔,30 s~1 min后終止消化,將原培養(yǎng)基和消化液一同離心,RF 2000 g/min離心5 min。其后,棄上清,用2 mL 4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮細胞,2000 g/min,離心5 min。重復(fù)上述步驟一次,棄PBS,加入100 μL Binding buffer,加入5 μL異硫氰酸熒光素(FITC),渦旋混勻后,加入10 μL碘化丙啶(PI),室溫避光孵育5 min,再補充加入400 μL Binding buffer后上機檢測。上述實驗重復(fù)3次。細胞總凋亡率=早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。
1.2.4 Western blot測蛋白表達量差異? 取對數(shù)生長期huh7細胞,接種于6孔板,待細胞貼壁24 h后,用不同藥物濃度(0、2.5、5、10、20和40 μmol /L)處理24 h。加入 4℃預(yù)冷的細胞裂解緩沖液100 μL后,冰上作用30 min。用細胞刮刀刮取細胞碎片和裂解產(chǎn)物,移入1.5 mL離心管。用超聲波細胞粉碎機粉碎上述產(chǎn)物后,4℃ 12 000 g/min高速冷凍離心20 min。BCA檢測法檢測蛋白濃度,用細胞裂解緩沖液調(diào)整各組間的蛋白濃度,使其一致,加入上樣緩沖液,100℃加熱5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳,將分離后蛋白電泳轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,洗膜3次后分別加入一抗(Akt、p-Akt、β-catenin及GAPDH)4℃搖床過夜孵育12 h,而后洗膜3次,加入二抗于搖床作用1 h,再次洗膜3次,于Odyssey上掃膜,并計算灰度值。上述實驗重復(fù)3次。相對灰度值=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法
應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用t檢驗,等級資料比較用秩和檢驗;計數(shù)資料用率表示,組間比較采用成組χ2檢驗,多組間比較采用方差分析,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 MK-2206對huh7的生長抑制作用
CCK-8實驗結(jié)果表明,不同濃度MK-2206處理huh7細胞24、48、72 h后均能抑制細胞生長增殖,且抑制效應(yīng)呈時間和濃度依賴性。MK-2206的24、48、72 h的半抑制濃度(IC50)分別為5.467、2.961、1.924 μmol/L。當(dāng)藥物濃度達到40 μmol/L時,在不同藥物作用時間下均可使huh7幾乎全數(shù)死亡。見圖1。
2.2 MK-2206對細胞凋亡的影響
取MK-2206濃度0、2.5、5、10、20和40 μmol/L,作用huh7細胞24 h后,利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。結(jié)果顯示,除外2.5 μmol/L,與空白對照組(0 μmol/L)比較,其余各濃度組的凋亡率明顯升高,且呈濃度依賴性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。見圖2、表1。當(dāng)藥物濃度達到40 μmol/L時,鏡下觀察,huh7細胞幾乎全數(shù)死亡,流式圖中呈現(xiàn)單一細胞團。其后增設(shè)濃度組,即取0、2.5、5、10、20、25、30、35和40 μmol/L作用于huh7細胞24 h后檢測細胞凋亡情況。結(jié)果當(dāng)藥物濃度達到30 μmol/L,即出現(xiàn)huh7細胞大量凋亡。見圖2A。
2.3 MK-2206對Akt/PI3K/mTOR信號通路的影響
藥物濃度達40 μmol/L時,huh7細胞出現(xiàn)大量凋亡,其提取所得蛋白的濃度過低,無法顯示出蛋白條帶。Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組(0 μmol/L)比較,Akt蛋白表達水平隨MK-2206的濃度升高而顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05);與空白對照組比較,p-Akt蛋白水平表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。見圖3。
3 討論
肝癌的發(fā)生率及死亡率呈上升趨勢,是我國沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。目前的治療方式使患者獲益有限,急需探索新的治療方式[10]。PI3K/Akt在多種腫瘤中高表達,參與腫瘤的惡性進展,同時在肝癌惡性進展及化療耐藥中起到重要的作用[11-12]。Akt作為PI3K的下游靶蛋白,是PI3K/Akt信號通路的核心靶點。因此,通過調(diào)控Akt表達可調(diào)整細胞增殖和凋亡的平衡,進而抑制腫瘤生長[13]。MK-2206可促進急性髓性白血病細胞的凋亡,并且增加阿糖胞苷的細胞毒性[14]。MK-2206可通過抑制MAPK信號通路抑制胃癌細胞生長[15]。同時,MK-2206也抑制結(jié)腸癌腫瘤干細胞的增殖[16]。在臨床研究中,MK-2206也展示出了良好的治療效果[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn),MK-2206可以抑制huh7細胞的增殖,且抑制效應(yīng)呈濃度和時間依賴性;MK-2206可以促進huh7細胞的凋亡,且呈濃度依賴性。MK-2206可通過抑制huh7中的PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。
本研究的不足之處:①實驗對象單一,缺乏體外實驗,后期可以對具有高侵襲能力的肝癌細胞系開展相關(guān)研究;②本研究只對PI3K/Akt信號通路上的關(guān)鍵蛋白進行了蛋白表達水平的驗證,缺乏對這兩條通路的下游靶蛋白表達水平的驗證;③本研究缺少凋亡相關(guān)蛋白的表達水平的驗證。
綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)Akt抑制劑MK-2206通過抑制PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞系huh7的凋亡,從而達到抑制腫瘤生長的目的。后期可進一步完善MK-2206對肝癌細胞抗腫瘤作用的研究。
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(收稿日期:2018-06-06? 本文編輯:王? ?蕾)