胡佳騰 宗茜 甘雨潔 刁柯彤 瞿天宇 徐懌琳 孫敏

1南京醫(yī)科大學(xué)(江寧校區(qū)) 211100; 2蘇州大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科 215000; 3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(江蘇省人民醫(yī)院)內(nèi)分泌科 210029

我國目前已經(jīng)成為全球糖尿病患者人數(shù)增長最快的國家，患病率達(dá)11.6%，近半數(shù)成年患者處于糖尿病前期階段[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)生成和鈣離子儲存的主要場所。機(jī)體對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能受損所作的反應(yīng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。早期出現(xiàn)大量錯誤折疊蛋白質(zhì)時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)一系列轉(zhuǎn)錄因子被激活，如人X盒結(jié)合蛋白(XBP)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)，可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理錯誤折疊蛋白質(zhì)的能力[2]。當(dāng)錯誤折疊蛋白質(zhì)過載，超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力，長期ERS即未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)可能會導(dǎo)致鈣離子釋放和氧化還原反應(yīng)，從而影響線粒體功能，引起細(xì)胞凋亡[3-4]。

目前，多項研究表明，ERS與糖尿病密切相關(guān)——長期的ERS會導(dǎo)致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生[5-6]。糖尿病并發(fā)癥主要包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病以及糖尿病腦病等[7]。而胰島素抵抗是糖尿病及其并發(fā)癥起病的重要始動因素，胰島β細(xì)胞功能衰竭所致的胰島素絕對或相對缺乏在各型糖尿病轉(zhuǎn)歸過程中也十分關(guān)鍵[8]。ERS主要影響胰島細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂等[9]。

分子伴侶是一類幫助肽鏈正確折疊的小分子，可通過與蛋白質(zhì)的相互作用，防止錯誤折疊產(chǎn)生[10]。4-苯基丁酸(4-PBA)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的一種，能穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象，提高受損蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸能力[11]。因此，深入研究4-PBA、ERS和糖尿病及其并發(fā)癥之間的關(guān)系，對提高糖尿病及其并發(fā)癥的臨床治療效果，減少相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率具有重要意義。

1 4-PBA簡介

4-PBA是一種低相對分子質(zhì)量的脂肪酸，能夠恢復(fù)錯誤折疊蛋白的構(gòu)象，從而保證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來發(fā)現(xiàn)，4-PBA具有對抗ERS引起的細(xì)胞凋亡的能力[12]。4-PBA可能通過抑制CHOP的表達(dá)，進(jìn)而抑制下游線粒體途徑，從而減輕ERS引起的細(xì)胞凋亡[13]。

目前，4-PBA已被用于尿素循環(huán)障礙、鐮狀細(xì)胞病和地中海貧血的治療[14]。4-PBA是治療阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征引起的快速血糖升高和胰島素抵抗的一個潛在靶點(diǎn)[15]。低濃度4-PBA可以選擇性地減輕ERS而不影響組蛋白H3乙酰化，改善左心室壓力過大性肥大，抑制主動脈縮窄相關(guān)的心肌間質(zhì)纖維化[16]。此外，4-PBA在糖尿病及其并發(fā)癥中也起重要作用。

2 4-PBA在糖尿病及其并發(fā)癥防治中的作用

2.1 對糖尿病發(fā)病機(jī)制的影響

2.1.1 改善胰島素分泌 胰島素的生物合成起始于胰島素原，胰島素原在胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的分子伴侶協(xié)助下進(jìn)行正確的氧化折疊，達(dá)到正確的構(gòu)象后，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸至高爾基體進(jìn)行剪切，產(chǎn)生胰島素和C肽[17-18]。而另一部分通過分子伴侶再折疊仍不能達(dá)到其正確構(gòu)象的蛋白質(zhì)，將通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬系統(tǒng)被降解[19]。各種因素誘導(dǎo)ERS后，胰島素分子無法在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行正確折疊，進(jìn)而影響生物活性胰島素的正確合成和釋放，這是糖尿病發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在2型糖尿病大鼠模型中，高糖誘發(fā)的ERS是損傷葡萄糖刺激胰島素分泌(GSIS)反應(yīng)的主要機(jī)制。而大鼠INS-1細(xì)胞經(jīng)300 μmol/L 4-PBA處理后，ERS相關(guān)蛋白如CHOP和G蛋白耦聯(lián)受體(GRP)78的表達(dá)受抑制，表明4-PBA可能改善GSIS受損，增加胰島素分泌[20]。

2.1.2 改善胰島素抵抗 在嚙齒動物糖尿病模型中，給予小鼠1 g/kg劑量的4-PBA口服治療，發(fā)現(xiàn)被蛋白顆粒前體損傷的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)得到恢復(fù)。在人體內(nèi)4-PBA能改善胰島素敏感性和β細(xì)胞功能[21]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予人HepG2細(xì)胞2 mmol/L 4-PBA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)慢性腎炎引起的Se-P硒蛋白表達(dá)，改善慢性腎炎引起的胰島素抵抗[22]。還有研究對4-PBA組和4-PBA+手術(shù)組的大鼠進(jìn)行腹腔注射50 mg/kg 4-PBA處理，發(fā)現(xiàn)兩組血漿脂肪酸和血糖濃度差別很小，而手術(shù)組的血漿游離脂肪酸、血糖、胰島素明顯高于4-PBA組和4-PBA+手術(shù)組，證明4-PBA能改善大鼠開胸手術(shù)后的胰島素抵抗[23]。

2.1.3 改善胰島細(xì)胞凋亡 ERS參與了膽固醇誘導(dǎo)的β細(xì)胞損傷，其中，CHOP介導(dǎo)的凋亡途徑可能部分地促進(jìn)了ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。4-PBA通過抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的上調(diào)和細(xì)胞凋亡，減輕膽固醇誘導(dǎo)的β細(xì)胞損傷[24]。另外，在大鼠心肌細(xì)胞H9C2中，0.5 μmol/L 4-PBA處理可緩解棕櫚酸誘發(fā)ERS，降低ERS標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)，改善細(xì)胞凋亡[25]。

2.1.4 減輕脂肪組織炎性反應(yīng) 對肥胖小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3-L1)進(jìn)行7.5 mmol/L的4-PBA預(yù)處理，可顯著降低3T3-L1細(xì)胞XBP-1 mRNA的表達(dá)，從而減輕ERS，表現(xiàn)為ERS標(biāo)志重鏈結(jié)合蛋白(BIP)、 CHOP、ATF4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)蛋白(EDEM)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)DnaJ同系物4(ERDJ4)的下調(diào)。此外，炎性相關(guān)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α與白細(xì)胞介素-6表達(dá)下降，也表明4-PBA可改善脂肪組織的慢性炎性反應(yīng)[26]。另外,瘦素和胰島素樣生長因子(IGF)-1水平的失調(diào)與肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化和心血管疾病相關(guān)。研究表明，游離脂肪酸攝入過多與代謝性疾病密切相關(guān)，而4-PBA可以抑制ERS，阻止其對瘦素和IGF-1表達(dá)的抑制[27]。2型糖尿病患者脂肪組織有大量M1型巨噬細(xì)胞聚集，4-PBA可影響巨噬細(xì)胞極化，可能參與減輕脂肪組織的炎性反應(yīng)，但是具體機(jī)制仍需要研究[28]。

2.2 改善糖尿病并發(fā)癥

2.2.1 改善妊娠糖尿病 有研究采用糖耐量正常的妊娠婦女和妊娠期糖尿病婦女分娩15 min內(nèi)的大網(wǎng)膜組織(排除哮喘、多囊卵巢綜合征、先兆子癇以及大血管并發(fā)癥)，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡處理，結(jié)果顯示ERS標(biāo)志基因GRP78、 XBP-1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1α(IRE1α)表達(dá)上調(diào)。而4-PBA可抑制高糖誘導(dǎo)的ERS，使上述標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)，孕婦體重顯著下降[29]。動物研究發(fā)現(xiàn)，4-PBA不僅對母體糖代謝有影響，對子代糖代謝也有調(diào)節(jié)作用。在小鼠妊娠糖尿病模型中發(fā)現(xiàn)，高血糖并非直接在胚胎滋養(yǎng)層引起ERS，而是引起了酮癥酸中毒，從而誘發(fā)輕度ERS。對人胚胎絨毛膜癌細(xì)胞進(jìn)行500 μmol/L 4-PBA處理24 h，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ERS標(biāo)志物eIF2α磷酸化減少，pH值降低，改善高血糖引起的ERS介導(dǎo)的胚胎病[30]。

2.2.2 改善糖尿病腎病 糖尿病腎病是一種由糖尿病引起的微血管病變，而高糖誘發(fā)的足細(xì)胞凋亡是其病變標(biāo)志。4-PBA能夠改善足細(xì)胞凋亡、微血管擴(kuò)張，從而改善多尿癥、高度肥胖和高血糖[31]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胚胎發(fā)育、慢性炎性反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在早期的糖尿病小鼠腎小管上皮細(xì)胞中，尾加壓素Ⅱ可以通過HK-2細(xì)胞中ERS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，4-PBA能抑制HK-2細(xì)胞中尾加壓素Ⅱ誘發(fā)的α平滑肌肌動蛋白和成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白1(FSP1)的表達(dá)[32]。在大鼠體內(nèi)，4-PBA通過減輕氧化應(yīng)激，顯著抑制大鼠糖尿病腎病的進(jìn)展[33]。此外，4-PBA有助于改善腎小球系膜增生，顯著減少尿路蛋白的排泄，對防治糖尿病腎病也起重要作用[11]。

2.2.3 改善糖尿病大血管病變 4-PBA能夠減輕由動脈粥樣硬化引發(fā)的剪切應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷，抑制單核巨噬細(xì)胞聚集和血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)，因此可用來防止內(nèi)皮功能障礙和減少血管并發(fā)癥[34-35]。同時，4-PBA抑制ERS和脂質(zhì)積累，從而增加心肌細(xì)胞存活率，減少糖尿病心肌病中的心肌脂毒性[36]。ERS通過增強(qiáng)泛素化減少大鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶2a蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致2型糖尿病患者發(fā)生心室舒張功能障礙，梗死后的致命性心力衰竭風(fēng)險也將明顯增加。而經(jīng)4-PBA預(yù)處理后，雖然沒有減輕2型糖尿病大鼠的體重和改善其血流動力學(xué)，但是其血糖水平降低了36%[37]。

2.2.4 改善糖尿病腦病 研究表明，糖尿病腦病可能是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡引起的。高糖誘發(fā)ERS，隨之激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)介導(dǎo)的核因子-κB炎性反應(yīng)信號。用4-PBA或特異性抑制劑阻斷JNK通路，可減輕高糖引起的炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，預(yù)防2型糖尿病大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡、炎性反應(yīng)及認(rèn)知障礙[38]。此外，糖尿病腦病大鼠的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是由泛素化蛋白酶系統(tǒng)(UPS)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解介導(dǎo)的。在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，UPS通過通道形成蛋白Derlin1和P97蛋白參與UPR過程。由于UPS活性降低，導(dǎo)致未折疊和錯誤折疊蛋白質(zhì)的清除減少，以此引發(fā)了ERS，長期的ERS導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞不可避免地走向凋亡。使用4-PBA調(diào)節(jié)UPR通路，可減輕糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，這可能會是未來一個治療糖尿病相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的靶點(diǎn)[39]。

2.2.5 改善糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病重要并發(fā)癥之一，糖尿病會影響視網(wǎng)膜上的Müller細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)高度氧化的低密度脂蛋白誘發(fā)Müller細(xì)胞內(nèi)ERS，從而加速細(xì)胞凋亡。4-PBA可減少由高度氧化的低密度脂蛋白誘發(fā)的ERS和細(xì)胞凋亡，降低TUNEL陽性細(xì)胞(細(xì)胞凋亡和DNA降解的生物標(biāo)志物)的數(shù)量，改善糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變[40]。

3 分子伴侶的治療潛力

ERS與代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如糖尿病、肥胖、心血管疾病以及脂肪肝[41]。研究表明，小分子伴侶對緩解動物模型的UPR具有良好的效果，如4-PBA和TUDCA。4-PBA對糖尿病胰島功能、胰島素敏感性和糖尿病并發(fā)癥具有改善作用[41]。然而，4-PBA是否能有效應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的臨床治療仍需要更多的臨床研究來驗(yàn)證，其改善ERS的具體分子機(jī)制尚需要更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。