李宏淼 馬連學(xué) 曾瑞霞 單偉

1錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室 121001; 2遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)撫礦總醫(yī)院(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第七臨床學(xué)院)檢驗(yàn)科，撫順 113008

Müller細(xì)胞為視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，在糖尿病狀態(tài)下，過(guò)度活化的Müller細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)損傷，引起血管生成因子增加，產(chǎn)生新生血管，進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎性視網(wǎng)膜環(huán)境，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1-3]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)為一類(lèi)具有神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、存活具有重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用NRG-1治療局灶性腦缺血大鼠模型，可發(fā)揮強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)作用，有效減少神經(jīng)元死亡數(shù)目[5]。盡早使用外源性NRG-1，可有效防止視神經(jīng)損傷大鼠模型中神經(jīng)元損傷，對(duì)于損傷后神經(jīng)再生、神經(jīng)功能的恢復(fù)大有益處[6]。但NRG-1對(duì)糖尿病狀態(tài)下Müller細(xì)胞損傷的影響尚不清楚。因此，本研究以高濃度葡萄糖培養(yǎng)Müller細(xì)胞，探討NRG-1對(duì)高葡萄糖對(duì)Müller細(xì)胞的影響及機(jī)制，為尋找糖尿病視網(wǎng)膜損傷的治療方案拓展思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 Müller細(xì)胞株購(gòu)自上海鈺博公司。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone生物科技有限公司；BCA 試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒、噻唑藍(lán)法(MTT)試劑盒、JC-1試劑盒、丙二醛含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒均購(gòu)自碧云天公司；Bcl-2、Bax、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SIM公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將Müller細(xì)胞株置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底達(dá)80%左右時(shí)傳代。24 h后給予不同處理因素，對(duì)各處理因素的劑量均進(jìn)行濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)最適濃度進(jìn)行分組培養(yǎng)，分為對(duì)照組(空白對(duì)照)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、NRG-1處理組(30 mmol/L葡萄糖+80 mg/L NRG-1)，3組均給與DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，并于培養(yǎng)的第3 天檢測(cè)指標(biāo)。

1.4 MTT檢測(cè)Müller細(xì)胞活力 調(diào)整Müller細(xì)胞懸液為1×104/200 μl，置于96孔板中培養(yǎng)，24 h細(xì)胞貼壁后分組處理，在培養(yǎng)第3 天時(shí)再換100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后加入5 g/L MTT溶液20 μl，3 h后棄溶液，加DMSO并振蕩，使藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處光吸收值(A值)，按如下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.5 試劑盒檢測(cè)Müller細(xì)胞丙二醛含量及SOD活性 用4℃生理鹽水制備5%Müller細(xì)胞勻漿，5 000 r/min(r=10 cm)離心30 min，取上清；按試劑盒操作得到OD值，根據(jù)OD值分別計(jì)算Müller細(xì)胞的丙二醛含量及SOD活性。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將各組細(xì)胞處理為單細(xì)胞懸液，以2×106個(gè)/ml接種6孔板中，培養(yǎng)48 h后常規(guī)消化，5 000 r/min(r=10 cm)離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗2次，按Annexin V-FITC說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.7 Western印跡檢測(cè)Müller細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，蛋白上樣量為40 μg加入15 μl樣品緩沖液。10% SDS-PAGE凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以含1% BSA的TBST室溫封閉2 h；加入一抗4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌4次，每次5 min；加入HRP標(biāo)記的二抗室溫2 h，孵育后TBST洗滌4次，每次5 min；ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)6次。

1.8 JC-1法檢測(cè)Müller細(xì)胞線粒體膜電位 傾去各組Müller細(xì)胞培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌1次，依次加入1 ml新培養(yǎng)基及1 ml JC-1染色液，混勻于培養(yǎng)箱中37℃裝載探針20 min。裝載探針后，將配置的JC-1染色緩沖液清洗各組Müller細(xì)胞2 次。熒光顯微鏡下觀察分析。

2 結(jié)果

2.1 各組Müller細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 通過(guò)顯微鏡簡(jiǎn)單觀察可發(fā)現(xiàn)，高糖組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，胞體腫脹，細(xì)胞邊緣折光性增強(qiáng)。與高糖組相比，NRG-1處理組上述狀態(tài)有所改善(圖1，封2)。

2.2 MTT法檢測(cè)Müller細(xì)胞活力 與對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞活力明顯降低；而與高糖組相比，NRG-1處理組細(xì)胞活力有所增加(P均<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3 各組Müller細(xì)胞丙二醛含量及SOD活力 與對(duì)照組相比，高糖組丙二醛含量明顯增加，SOD活力明顯降低。而與高糖組相比，NRG-1處理組丙二醛含量明顯減少，SOD活力明顯增加(P均<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 3組細(xì)胞活力、丙二醛含量、SOD活性比較

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯增加；而與高糖組相比，NRG-1處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P均<0.01)，見(jiàn)表2，圖2(封2)。

2.5 Western印跡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，促凋亡Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2/Bax比值降低；而與高糖組相比，NRG-1處理組Bcl-2表達(dá)明顯增加，Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2/Bax比值升高(P均<0.01)，見(jiàn)圖3，表2。

2.6 3組Müller細(xì)胞線粒體膜電位 JC-1在正常線粒體聚集呈現(xiàn)紅色熒光，而在線粒體損傷、膜電位降低時(shí)成單體呈現(xiàn)綠色熒光。與對(duì)照組相比，高糖組Müller細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低；而與高糖組相比，NRG-1處理組線粒體膜電位明顯增加(P均<0.01)，見(jiàn)圖4(封2)，表2。

表2 3組Müller細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、Bax表達(dá)比較

甲狀腺微小癌的熱消融治療

3 討論

研究表明，除微血管病變外，視網(wǎng)膜神經(jīng)組織病變?cè)谔悄虿∫暰W(wǎng)膜病變的發(fā)展中也非常關(guān)鍵，其主要病理表現(xiàn)有Müller細(xì)胞凋亡、谷氨酸堆積的毒性作用等[7-9]。本研究對(duì)正常的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞株進(jìn)行高濃度葡萄糖處理進(jìn)而模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變時(shí)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的損傷狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下，Müller細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，胞體腫脹，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，最終會(huì)引起Müller細(xì)胞的凋亡。

Müller細(xì)胞為視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞，可跨越整個(gè)視網(wǎng)膜，幾乎與每種細(xì)胞類(lèi)型都有接觸，其獨(dú)特的位置使其對(duì)保持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)尤為重要[1]。視網(wǎng)膜功能正常時(shí)，Müller細(xì)胞可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)，防止谷氨酸毒性，通過(guò)空間緩沖并重新分配離子，參與視網(wǎng)膜循環(huán)，從而調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。任何對(duì)視網(wǎng)膜環(huán)境的干擾都會(huì)影響Müller細(xì)胞的正常功能，從而參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[10]。氧化應(yīng)激是細(xì)胞組織病變時(shí)，活性氧簇生成增多攻擊細(xì)胞及組織的現(xiàn)象[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Müller細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)有關(guān)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)最終會(huì)引起Müller細(xì)胞的凋亡[12-13]。丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，SOD是自由基清除劑。丙二醛含量上調(diào)，SOD活性下降，可間接反映組織氧化應(yīng)激程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下Müller細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，胞體腫脹，丙二醛含量升高，SOD活性降低，細(xì)胞活力明顯下降，而細(xì)胞凋亡率明顯增加，提示高糖環(huán)境下會(huì)引起Müller細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。對(duì)高糖環(huán)境下的Müller細(xì)胞給予NRG-1治療后，丙二醛含量降低，SOD活性增加，細(xì)胞活力明顯增加，而凋亡率明顯下降。說(shuō)明NRG-1可降低氧化應(yīng)激水平，抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞凋亡。NRG-1在神經(jīng)病變領(lǐng)域一直備受關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5依賴(lài)的絲裂原活化蛋白激酶途徑，減緩腦缺血-再灌注損傷的病變[15]。另外，NRG-1還可通過(guò)調(diào)節(jié)酪氨酸激酶受體2受體通路，緩解脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相關(guān)疾病的損傷[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)，對(duì)腦卒中大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[17]。Müller細(xì)胞軸突內(nèi)含有豐富的線粒體，糖尿病狀態(tài)下易造成線粒體損傷，從而導(dǎo)致線粒體膜電位降低，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)異常，最終引起細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值降低，線粒體膜電位降低，細(xì)胞凋亡率增加，提示高糖環(huán)境下Müller細(xì)胞的凋亡可能與線粒體凋亡通路有關(guān)。給予NRG-1處理后，Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值增加，線粒體膜電位也隨之增加，細(xì)胞凋亡率明顯下降，說(shuō)明NRG-1可抑制Müller細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)。

綜上所述，高糖環(huán)境下可激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而誘導(dǎo)Müller細(xì)胞凋亡。NRG-1可抑制高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制線粒體凋亡途徑有關(guān)。但因糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，NRG-1對(duì)糖尿病時(shí)Müller細(xì)胞損傷的作用還有待進(jìn)一步探討。