石悅 焦奧 林建貞 張城碩 孫寧 張佳林

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽 110001

人胰島淀粉樣多肽(hIAPP)是由胰島β細胞分泌的一種激素，由37個氨基酸構(gòu)成[1]。hIAPP與胰島素共同存儲在β細胞分泌囊泡中，并以固定比例同步分泌[2]。生理條件下，hIAPP有協(xié)助調(diào)節(jié)人體血糖水平的功能。單體hIAPP無細胞毒性，但其在病理條件下有極強的自我聚集傾向，聚集過程中形成的寡聚體及富含β-折疊結(jié)構(gòu)的淀粉樣聚集體可以對β細胞的功能造成損害[3]，并導致2型糖尿病和胰島移植物的功能失活[4]。

腦啡肽酶屬于中性內(nèi)肽酶M13家族，為細胞表面的含鋅離子(Zn2+)的Ⅱ型膜蛋白。國外多項研究表明，腦啡肽酶能夠水解hIAPP以抑制其聚集，從而保護β細胞功能[5]。Glutaryl-Ala-Ala-Phe-4-methoxy-2-naphthylamine(GAAF-4-MNA)是腦啡肽酶的特異性水解底物[6]。

硫黃素T是一種熒光染料，較容易與富含β-折疊結(jié)構(gòu)的分子結(jié)合，改變其光學性質(zhì)，從而在藍色激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，可用來探測hIAPP形成的淀粉樣聚集體。本研究團隊的前期研究針對hIAPP容易形成聚集的第11～15位氨基酸位點自行設計并在體外合成一種短肽，其序列為FLPNF(苯丙氨酸-亮氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸)，并應用硫黃素T染色發(fā)現(xiàn)其可以在緩沖液中抑制hIAPP形成聚集，其原理為直接結(jié)合hIAPP，從而抑制hIAPP的自身聚集[7]。但FLPNF能否抑制細胞內(nèi)hIAPP的聚集及其機制尚不清楚。本研究旨在探討FLPNF對細胞內(nèi)hIAPP聚集，及對細胞增殖活力、胰島素分泌功能的影響，并且通過酶活性測定法探討FLPNF在細胞內(nèi)通過增加腦啡肽酶的活性來抑制hIAPP形成聚集，同時應用以往報道中能夠在緩沖液中促進hIAPP形成聚集的短肽NFGAIL作為陰性對照短肽進行研究，為進一步探索FLPNF對2型糖尿病的防治作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng) 大鼠胰島素瘤細胞株INS-1購自上海拜力生物科技有限公司，為本實驗室凍存；hIAPP-INS-1細胞株，及空轉(zhuǎn)染慢病毒的細胞株CON-INS-1為本實驗室凍存[8]。復蘇后的上述細胞均培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，添加10 mmol/L HEPES、2 mmol/LL-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉、10 μmol/L β -巰基乙醇、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素[9]。細胞培養(yǎng)皿靜置于37℃含5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)等購自Hyclone公司；β巰基乙醇購自上海棋成實業(yè)有限公司；硫黃素T、腦啡肽酶水解底物GAAF-4MNA、亮氨酸氨肽酶(L-AP)、腦啡肽酶抑制劑——膦酰二肽、MES緩沖液、脫氧膽酸鈉、氟化鈉、焦磷酸鈉、甘油等均購自上海Sigma-Aldrich公司；HEPES液、氯化鈉、Triton X-100、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、正釩酸鈉、氯化鎂、苯甲基磺酰氟(PMSF)等均購自上海碧云天生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；多聚甲醛購自武漢賽維爾生物科技有限公司；短肽FLPNF、短肽NFGAIL購自上海強耀生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)等購自北京索萊寶科技有限公司；MTS試劑盒購自Promega公司；大鼠胰島素ELISA檢測試劑盒購自Mercodia公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、化學發(fā)光儀為美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；倒置相差顯微鏡為日本Nikon公司生產(chǎn)；深低溫冰箱為日本Sanyo公司生產(chǎn)；全自動酶標儀為瑞士SUNRISERC公司生產(chǎn)；熒光顯微鏡為上海中恒公司生產(chǎn)。

1.3 實驗分組與處理 10 μl DMSO溶液溶解FLPNF及NFGAIL，并分裝備用；膦酰二肽用10 μl DMSO溶液溶解備用；硫黃素T稱重并用甲醇溶解備用。

驗證hIAPP-INS-1細胞中的hIAPP聚集情況實驗分為3組，分別為INS-1對照組、CON-INS-1對照組及hIAPP-INS-1組；FLPNF對hIAPP-INS-1細胞內(nèi)hIAPP聚集、增殖活力及胰島素分泌功能的影響實驗按照加入的短肽FLPNF濃度分為0 μmol/L組、100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組及800 μmol/L組，加入不同濃度的NFGAIL為陰性對照組，加入藥物處理時間為72 h；腦啡肽酶活性測定實驗分為空白對照組、FLPNF組、NFGAIL組及膦酰二肽組；FLPNF通過增強腦啡肽酶活性抑制hIAPP的聚集實驗分為空白對照組、FLPNF組、FLPNF+膦酰二肽組、NFGAIL組、NFGAIL+膦酰二肽組及膦酰二肽組，各組細胞經(jīng)藥物處理時間為72 h，其中FLPNF+膦酰二肽組及NFGAIL+膦酰二肽組采用FLPNF或NFGAIL與膦酰二肽同時處理細胞的方式添加，F(xiàn)LPNF及NFGAIL的濃度為200 μmol/L，膦酰二肽濃度為50 μmol/L。

1.4 硫黃素T熒光染色 取對數(shù)生長期細胞，按照2×105細胞/孔接種到12孔培養(yǎng)板，每個實驗條件設置3個復孔。待細胞貼壁后，給與相應的藥物處理后，PBS洗去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液和死細胞，4%多聚甲醛固定細胞15 min，20 μmol/L硫黃素T染色，避光作用8 min，70%酒精清洗1次，PBS緩沖液清洗1次，室溫靜置30 min，熒光顯微鏡觀察熒光并拍照。

取藥物處理后的對數(shù)生長期細胞消化后以1×104細胞/孔接種到黑色96孔熒光板中，每個實驗條件設置3個復孔。待細胞貼壁后，行硫黃素T熒光染色，染色方法同前。染色后將96孔熒光板放入化學發(fā)光儀中測定激發(fā)/發(fā)射波長：435 nm/485 nm處的熒光強度值，得到每10 000個細胞的熒光強度，制作柱形圖并統(tǒng)計分析。

1.5 MTS法測定細胞增殖活力 取藥物處理后的對數(shù)生長期細胞，消化后以2×103細胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，每組細胞設置3個復孔。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl MTS溶液，于37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。待MTS孵育結(jié)束后，將96孔板放入酶標儀中測定各孔在490 nm處的吸光度值。

1.6 ELISA法檢測葡萄糖刺激的胰島素分泌功能 取對數(shù)生長期細胞，消化后以2×103細胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，每組細胞設置3個復孔。經(jīng)藥物處理后，用PBS緩沖液洗滌細胞2次，每孔加入不含葡萄糖的KRBH液100 μl，于37℃細胞孵箱中孵育30 min，棄除KRBH液后再用含有低糖(2 mmol/L)或高糖(20 mmol/L)的KRBH液孵育1 h，抽出孵育液至離心管中，12 000 r/min，離心半徑4 cm，離心10 min，收集上清液作為胞外樣品；同時細胞板各孔加入100 μl的RIPA裂解液，吹打均勻后，抽出裂解液至離心管中，12 000 r/min，離心半徑4 cm，離心10 min，收集上清液作為胞內(nèi)樣品。在96孔板中加入標準品或樣品，每孔50 μl，稀釋標準品，制作標準曲線。每孔加入樣品稀釋液40 μl及樣品10 μl，空白對照孔加入樣品稀釋液40 μl及完全培養(yǎng)基10 μl，封閉后37℃孵箱中孵育30 min。每孔300 μl洗滌液連續(xù)洗滌5次。棄除洗滌液后，各孔加入酶標試劑50 μl，空白對照孔中不加。封閉后37℃孵箱中孵育30 min。每孔300 μl洗滌液連續(xù)洗滌5次。棄除洗滌液后，每孔加入顯色劑A與顯色劑B各50 μl，混勻后于室溫避光靜置15 min。顯色后每孔加入終止液50 μl，將96孔板放入酶標儀中測定各孔在450 nm處的吸光度值。分別計算各組在低糖或高糖孵育下的胞外與胞內(nèi)樣品吸光度值的比值，作為各組胰島素分泌量占胞內(nèi)胰島素含量的百分比，進行統(tǒng)計分析。

1.7 腦啡肽酶活性測定 取對數(shù)生長期的hIAPP-INS-1細胞，消化后以5×105細胞/孔接種到6孔培養(yǎng)板中，每組細胞設置3個復孔。細胞貼壁后，加入FLPNF、NFGAIL或膦酰二肽處理24 h。PBS洗去細胞培養(yǎng)板中的死細胞。加入裂解液(50 mmol/L HEPES液，pH 7.4，150 mmol/L氯化鈉，1% Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS，1 mmol/L EGTA，1.5 mmol/L氯化鎂，1 mmol/L正釩酸鈉，100 mmol/L氟化鈉，10 mmol/L焦磷酸鈉，10%甘油，1 mmol/L PMSF)，冰上裂解細胞5 min；將裂解液移入離心管中，12 000 r/min(r=4 cm)，離心15 min；取上清，進行蛋白定量。

取黑色96孔熒光板，每組加入經(jīng)定量并稀釋成3 g/L的蛋白樣品10 μl，每組設置3個復孔。每孔反應體系為100 μl(含MES緩沖液20 mmol/L，GAAF-4-MNA 100 μmol/L)，避光反應0 min及30 min，再加入0.3 g/L的L-AP10 μl，避光反應10 min。化學發(fā)光儀分別測定激發(fā)波長340 nm，吸收波長425 nm下，各孔在30 min與0 min的熒光強度值的差值，并與空白對照組的比值作為相對熒光強度，繪制柱形圖并統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 hIAPP在hIAPP-INS-1細胞中的聚集情況及對細胞增殖活力、胰島素分泌功能的影響 在細胞貼壁并孵育48 h后，熒光顯微鏡下hIAPP-INS-1組細胞的胞內(nèi)綠色熒光顯著強于INS-1對照組及CON-INS-1組，化學發(fā)光儀測定顯示hIAPP-INS-1組細胞熒光強度較INS-1對照組及CON-INS-1對照組明顯增強(F=367.750，P<0.01)，見圖1A(插1)。在細胞貼壁48 h后hIAPP-INS-1組細胞增殖活力較INS-1對照組及CON-INS-1對照組顯著降低(F=8.388，P<0.05)，見圖1B(插1)。ELISA法檢測葡萄糖刺激的胰島素分泌功能結(jié)果顯示，細胞貼壁48 h后，與INS-1對照組及CON-INS-1對照組相比，hIAPP-INS-1組細胞在高糖環(huán)境下的胰島素分泌量有降低的趨勢(F=3.058，P>0.05)，見圖1C(插1)。

2.2 不同濃度FLPNF對hIAPP-INS-1細胞內(nèi)hIAPP聚集的影響 圖2A(插2)為硫黃素T染色下，熒光顯微鏡觀察加入不同濃度FLPNF對hIAPP-INS-1細胞胞內(nèi)綠色熒光的影響；圖2C(插2)為化學發(fā)光儀檢測上述各組熒光強度的變化情況。與0 μmol/L組相比，加入不同濃度FLPNF(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L)后，100 μmol/L組較0 μmol/L組的熒光強度顯著降低(F=14.442，P<0.05)；與0 μmol/L組相比，200 μmol/L組、400 μmol/L及800 μmol/L組的熒光強度降低則更為明顯(F=14.442，P<0.05)，且后3組的綠色熒光強度差異不明顯，由此可見FLPNF抑制hIAPP聚集的作用濃度以200 μmol/L為宜。而如圖2B、2D(插2)所示，加入不同濃度NFGAIL后，hIAPP-INS-1細胞胞內(nèi)綠色熒光強度均較0 μmol/L組無顯著變化(F=0.312，P>0.05)。

2.3 FLPNF對hIAPP-INS-1細胞增殖活力及胰島素分泌功能的影響 圖3A為MTS法檢測加入不同濃度FLPNF及NFGAIL對CON-INS-1細胞及hIAPP-INS-1細胞增殖活力的影響。結(jié)果顯示，在hIAPP-INS-1細胞中加入不同濃度FLPNF(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L)后，細胞活力較0 μmol/L組均升高；其中100 μmol/L組較0 μmol/L組有顯著差異(F=4.151，P<0.05)，200 μmol/L及400 μmol/L組較0 μmol/L組差異更明顯(F=4.151，P<0.05)；而加入不同濃度FLPNF后，CON-INS-1細胞增殖活力無明顯變化(F=2.991，P>0.05)。結(jié)果表明,FLPNF可能通過抑制hIAPP的聚集從而對細胞增殖活力起到保護作用。而如圖3B所示，加入不同濃度NFGAIL后，兩種細胞增殖活力均較0 μmol/L組無顯著變化。

hIAPP-INS-1細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度FLPNF及NFGAIL后，ELISA法測定低糖及高糖環(huán)境下，胞內(nèi)及胞外胰島素含量。如圖3C所示，在低糖(2 mmol/L)條件下，加入不同濃度FLPNF及NFGAIL(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L)與0 μmol/L組的胰島素分泌量差異無統(tǒng)計學意義；在高糖(20 mmol/L)刺激下，加入不同濃度FLPNF各組的胰島素分泌量雖然無顯著增加，但有增加的趨勢(F=0.603，P>0.05)，其中200 μmol/L組在高糖刺激下的胰島素分泌量占胞內(nèi)胰島素含量的比例最高。如圖3D所示，在高糖(20 mmol/L)刺激下，加入不同濃度NFGAIL各組較0 μmol/L組胰島素分泌量無增高趨勢(F=0.066，P>0.05)。

2.4 FLPNF通過增強腦啡肽酶活性抑制hIAPP的聚集 圖4A(插1)為酶活性測定法檢測FLPNF對hIAPP-INS-1細胞內(nèi)腦啡肽酶活性的影響。200 μmol/L FLPNF及NFGAIL分別加入hIAPP-INS-1細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，F(xiàn)LPNF組腦啡肽酶活性增加程度為空白對照組的2.356倍，有顯著差異(F=84.265，P<0.01)；而NFGAIL組腦啡肽酶活性的增加則較空白對照組無明顯差異。培養(yǎng)基中加入膦酰二肽 50 μmol/L作為陰性對照組(膦酰二肽組)，結(jié)果腦啡肽酶活性較空白對照組顯著降低(0.103倍，F(xiàn)=84.265，P<0.01)。通過硫黃素T染色后化學發(fā)光儀檢測各組hIAPP-INS-1細胞胞內(nèi)的熒光強度，驗證FLPNF通過增強腦啡肽酶活性影響hIAPP的聚集。結(jié)果如圖4B(插1)所示，F(xiàn)LPNF組熒光強度較空白對照組顯著降低(P<0.05)；FLPNF+膦酰二肽組熒光強度較空白對照組稍有增加，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但相比之下較FLPNF組明顯增加(F=9.868，P<0.05)，而相比膦酰二肽組仍有所降低。加入對照短肽NFGAIL組熒光強度較空白對照組無明顯差異(P>0.05)，NFGAIL+膦酰二肽組熒光強度較空白對照組升高明顯(F=9.868，P<0.05)。圖4C(插1)為應用熒光顯微鏡觀察上述各組綠色熒光情況，F(xiàn)LPNF組胞內(nèi)綠色熒光較空白對照組降低，而FLPNF+膦酰二肽組較FLPNF組綠色熒光增加。

3 討論

hIAPP是2型糖尿病患者胰島β細胞胞外形成淀粉樣聚集的主要成分，其聚集過程中形成的可溶性寡聚體及不溶性纖維淀粉狀沉積可導致β細胞的死亡[10]。因此，抑制hIAPP聚集的形成將成為開發(fā)治療2型糖尿病及保護胰島移植物功能的相關藥物的主要策略之一。很多研究表明，有些短肽能夠抑制hIAPP形成淀粉樣聚集[11-12]。但是目前短肽類抑制劑抑制hIAPP聚集的具體機制尚不十分清楚。

本研究團隊根據(jù)hIAPP容易形成聚集的氨基酸位點自行設計了短肽FLPNF，前期研究結(jié)果表明，此短肽在緩沖液中具有抑制hIAPP形成聚集的作用，這種作用機制為FLPNF與hIAPP的直接結(jié)合[7]。但FLPNF在胞內(nèi)抑制hIAPP聚集的作用機制尚不明確。

通過硫黃素T染色結(jié)果可以觀察到前期構(gòu)建的hIAPP-INS-1細胞可穩(wěn)定表達hIAPP，且由于hIAPP的聚集導致細胞增殖活力及胰島素分泌功能受損。在本研究中，F(xiàn)LPNF能夠顯著抑制hIAPP在胞內(nèi)的聚集，雖然細胞內(nèi)hIAPP并未完全被抑制，但相對于陰性對照短肽NFGAIL，已經(jīng)有了很大程度的降低。且比較不同濃度，200 μmol/L FLPNF可抑制hIAPP聚集，而100 μmol/L FLPNF的作用較200 μmol/L組差，400 μmol/L、800 μmol/L FLPNF的效果與200 μmol/L FLPNF抑制hIAPP聚集作用差異無統(tǒng)計學意義，所以200 μmol/L為FLPNF的最適濃度。

在hIAPP-INS-1細胞內(nèi)，通過MTS法及ELISA法觀察到細胞經(jīng)不同濃度FLPNF處理后，細胞的增殖活力得到改善，高糖刺激下胰島素分泌量有增加的趨勢。與硫黃素T染色結(jié)果類似，200 μmol/L FLPNF能起到較好的保護hIAPP-INS-1細胞活力及功能的作用。而對于陰性對照的CON-INS-1細胞，不同濃度的FLPNF對細胞增殖活力均無明顯改善，說明FLPNF通過抑制胞內(nèi)的hIAPP聚集，減輕了hIAPP形成的寡聚體及淀粉樣聚集對細胞增殖活力的損害。

在胰島β細胞中有多種途徑可以促進hIAPP的降解，包括自噬-溶酶體途徑、泛素-蛋白酶體途徑及胞內(nèi)直接水解hIAPP的蛋白酶，如腦啡肽酶、胰島素降解酶等。其中腦啡肽酶由742個氨基酸組成，有研究報道，腦啡肽酶能夠水解體內(nèi)的肽包括腦啡肽、速激肽、P物質(zhì)、內(nèi)皮素、緩激肽和心房鈉利尿肽等[13]。腦啡肽酶的活性測定方法國內(nèi)外也有很多文獻報道，利用其水解底物GAAF-4-MNA、GAAF-AMC或Suc-AAF-AMC來測定[6]。本研究選用底物GAAF-4-MNA，應用酶活性測定法驗證FLPNF可顯著增強細胞內(nèi)腦啡肽酶的活性。進一步采用腦啡肽酶抑制劑膦酰二肽驗證了FLPNF能夠通過影響腦啡肽酶的活性，使hIAPP的聚集減少。FLPNF+膦酰二肽組hIAPP聚集量較FLPNF組明顯增多，證明FLPNF抑制hIAPP聚集功能在一定程度上是通過影響腦啡肽酶的活性實現(xiàn)的。另一方面，F(xiàn)LPNF+膦酰二肽組與膦酰二肽組相比，hIAPP的聚集量仍然有減少的趨勢，說明FLPNF不僅通過腦啡肽酶抑制hIAPP聚集，還可能通過其他方式減少hIAPP的聚集。在本研究中，針對FLPNF增強腦啡肽酶的活性只進行了初步的探索，然而FLPNF具體通過何種方式增強腦啡肽酶的活性，還需進一步的研究來證實。

本研究應用過表達hIAPP的大鼠胰島素瘤細胞作為研究對象，證實FLPNF能夠抑制hIAPP-INS-1細胞中的hIAPP的聚集，具有明顯的保護hIAPP-INS-1細胞增殖活力的作用，并能夠改善細胞的胰島素分泌功能，并且進一步證明了FLPNF可通過增強腦啡肽酶的活性來減少細胞內(nèi)hIAPP的聚集。在以后的研究中，需進一步行動物體內(nèi)研究證實其作用，還可以在此短肽序列的基礎上應用如聚乙二醇修飾等方法來增強短肽的穩(wěn)定性，或加入其他修飾增強FLPNF的抑制效能[14-15]。本研究從細胞層面探討和證明了FLPNF抑制hIAPP聚集及對胰島細胞功能的保護作用，為開發(fā)更加經(jīng)濟、高效的hIAPP聚集抑制劑奠定基礎，可能在2型糖尿病的預防和治療方面具有較好的應用前景和臨床意義。