周雪燕,辛敏漢,肖婧,程衛(wèi)東,史學(xué)偉*
(1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.石河子大學(xué) 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 石河子 832000)
氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,常簡稱為 EC),又名脲烷(urethane),是煙草葉及香煙的天然成分,也是發(fā)酵食品[1]與酒精飲品[2]發(fā)酵或貯存過程中的伴隨產(chǎn)物[3,4]。20世紀(jì)40年代,Nettleship實(shí)驗證明 EC具有致癌作用,EC可以引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等?,F(xiàn)今EC被廣泛用于工業(yè)涂料及動物麻醉[5]。作為一種水溶性的致癌物質(zhì),已成為2002年FAO重點(diǎn)監(jiān)控物質(zhì),國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定其含量不得超過20μg/L[6]。就食品行業(yè)而言,面包、醬油、葡萄酒、中國黃酒等生活必需品不斷發(fā)展,其伴隨產(chǎn)物EC的產(chǎn)生是無法避免的,對食品及飲料中的EC采取適宜又安全的方法將其含量降低至安全限量以下具有實(shí)質(zhì)性的必要。
目前研究的降解或控制氨基甲酸乙酯的生成有多種方式,主要從控制EC前體物質(zhì)、控制EC的產(chǎn)生條件和使用EC水解酶直接去除3個方面進(jìn)行處理。如通過控制發(fā)酵食品的發(fā)酵條件、向食品中添加脲酶、選育低產(chǎn)尿素酵母菌來進(jìn)行發(fā)酵等方法來減少發(fā)酵產(chǎn)酒時生成氨基甲酸乙酯的問題。研究表明,生物酶法降解EC是一種溫和、安全有效的方法。綜上所述,篩選產(chǎn)EC降解酶酵母菌株并研究其產(chǎn)酶特性具有重要的意義。
1.1.1 菌種
選取保藏于石河子大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗室的酵母菌株。
1.1.2 培養(yǎng)基
酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)[7]:瓊脂2.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%,酵母浸粉1.0%,用蒸餾水配制,自然pH,121℃高壓滅菌20min。
篩選培養(yǎng)基:氨基甲酸乙酯(EC)2.5~20g/L,氯化鈉2g/L,硫酸銨4g/L,磷酸二氫鉀2.5g/L,磷酸氫二銨10g/L,七水合硫酸鋅0.2g/L,七水合硫酸鎂0.5g/L,七水合硫酸亞鐵0.05g/L,四水合硫酸錳0.15g/L,瓊脂粉20g/L,pH 5.0。
種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸粉1%,自然pH。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨1%,酵母浸粉2%,自然pH,EC 5g/L。
1.1.3 主要試劑與儀器
氨基甲酸乙酯、甲酰胺、氨基甲酸甲酯、N-甲基乙酰胺:美國Sigma公司;乙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、亞硝基鐵氰化鈉、苯酚、次氯酸鈉、氫氧化鈉:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf儀器公司;LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;CX21FS1光學(xué)顯微鏡 Olympus公司;722紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TC-512PCR擴(kuò)增儀 英國 Techne公司;Power Pac Universal水平電泳儀、Gel DOC X0R凝膠成像系統(tǒng) 美國BioRad公司。
顯色劑Ⅰ:稱取30g苯酚和1.25g亞硝基鐵氰化鈉溶于超純水并定容至500mL后冷藏于冰箱。顯色劑Ⅱ:稱取26.25g氫氧化鈉和15mL次氯酸鈉超純水定容至500mL后冷藏于冰箱。終止劑:10%的TCA。底物溶液:用0.05mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)配制成3%EC溶液后冷藏。
1.2.1 EC降解菌株的篩選
將保藏的36株菌株接種于YPD培養(yǎng)基中,于28℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)24h,挑取單菌落,再以EC為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)24h后,選取既可以在高濃度EC又可以在低濃度EC篩選培養(yǎng)基上生長的菌株作為EC降解菌株。
1.2.2 菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析
EC降解菌株的DNA采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取,根據(jù)試劑盒提供藥品及方法提取。
PCR 擴(kuò)增如下[8]:
上游引物:ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3');
下游引物:ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。
擴(kuò)增體系:總體積為50μL:2μL的模板DNA,2μL的上游引物,2μL的下游引物,25μL的Easy Taq Supermix,19μL的ddH2O,并做空白對照。
將符合標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)BLAST中進(jìn)行同源序列比對:下載相似性在99%以上菌種的序列,連同測序菌株的序列用Claustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對,結(jié)果采用MEGA 6.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行1000次置信度分析[11]。
1.2.3 EC降解酶活力測定方法
1.2.3.1 酶活測定步驟
準(zhǔn)確吸取200μL酶液于比色管中(空白對照:將酶液在沸水中保溫20min,使酶液失活),加入800μL底物溶液,30℃水浴20min后加1mL終止劑終止反應(yīng)?;靹蚝蠹尤?mL顯色劑Ⅰ,混勻后再加1mL顯色劑Ⅱ混勻,30℃水浴保溫20min,用超純水定容至10mL,測定OD625。
式中:ΔOD625為測定的EC降解酶反應(yīng)后與空白樣品光密度之差;n為酶活測定液稀釋倍數(shù);k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù);10為樣品的稀釋倍數(shù);20為酶作用的時間(min)。
1.2.3.2 NH4+標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
圖1 NH4+標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線Fig.1 NH4+ standard curve
將氨水配成0.1mol/L的NH4+溶液,再分別配制成0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mmol/L 的 NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)濃度NH4+溶液,分別置于編號的比色管中,在50℃下水浴30min,加入1mL終止液,充分混勻,再依次加入1mL顯色劑Ⅰ和顯色劑Ⅱ振蕩并充分混勻,反應(yīng)20min,用超純水定容至10mL,在625nm下比色測定OD值,以O(shè)D值為縱坐標(biāo),NH4+標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)作圖,標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。
1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化
熱敏灸聯(lián)合枇杷清肺飲加減方治療尋常性痤瘡的臨床觀察…………………………………………………… 黃 青等(2):229
1.2.4.1 培養(yǎng)基優(yōu)化
碳源及其濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:將蔗糖、麥芽糖、葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)(總量均為20g/L),菌株按4%的接種量接種,在30℃,200r/min條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng)4天,分別取樣測定其發(fā)酵產(chǎn)酶情況。篩選出合適的碳源之后,將其碳源濃度分別設(shè)置為10,20,30,40,50,60g/L,得到菌體發(fā)酵產(chǎn)酶最佳時的碳源濃度。
氮源及其濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:以葡萄糖為碳源,分別用不同的氮源:酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、硫酸銨+酵母粉、蛋白胨+硫酸銨、酵母粉+蛋白胨+硫酸銨(1∶1∶2)代替搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源物質(zhì),其余條件同上,按期取樣測定菌株的產(chǎn)酶情況。選出合適的氮源之后,設(shè)置不同的氮源濃度10,20,30,40,50,60,70g/L來研究其對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。
無機(jī)鹽對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加 濃 度 為 1mmol/L 的 CuSO4,F(xiàn)eSO4,ZnSO4,MnSO4,KH2PO4及CaCl2,以不添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基作為空白對照,其他條件均相同,考察無機(jī)鹽對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶情況的影響。
底物濃度對菌體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響:分別在對數(shù)中期向培養(yǎng)基中添加濃度為2.5,5.0,7.5,10.0g/L的底物EC,以不添加EC為對照,考察初始底物濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。
1.2.4.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化
將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng),發(fā)酵過程中每隔12h取樣測定其發(fā)酵產(chǎn)酶量。
將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別于25,28,30,33,35℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng),測定同上。
將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始 pH 分別為 3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,在30℃,200r/min條件下?lián)u床震蕩培養(yǎng),測定同上。
將菌株按4%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,初始 pH 6.0,裝液量分別為10%,20%,30%,40%,50%,60%,于30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng),測定同上。
按接種量分別為2%,4%,6%,8%,10%,12%將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基初始pH 6.0,裝液量75mL,在30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng),測定同上。
1.2.5 正交試驗驗證
采用正交試驗對其顯著的因素進(jìn)行試驗設(shè)計,并進(jìn)行驗證。
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取底物濃度、培養(yǎng)時間、初始pH、裝液量、溫度、氮源濃度6個因素為考察對象,以及各個因素最優(yōu)的3個水平,以發(fā)酵產(chǎn)酶能力為評價指標(biāo),進(jìn)行6因素3水平L18(37)正交試驗。
采用Origin 8.0軟件進(jìn)行單因素分析,用DPS軟件進(jìn)行正交分析。
將實(shí)驗室已存的36株酵母菌在篩選培養(yǎng)基上初步篩選得到6株產(chǎn)EC降解酶菌株,分別為N6,P2,Y13,Y18,Y4,Y9。增加EC濃度,對6株菌進(jìn)一步復(fù)篩,結(jié)果表明 Y4,Y9,Y13,N6在EC最高濃度為17.5g/L的培養(yǎng)基上正常生長,菌落形態(tài)見圖2。
圖2 酵母菌菌落形態(tài)Fig.2 Yeast colony morphology
提取菌株N6,Y13,Y9,Y4的DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)展,將PCR擴(kuò)展產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖3。4株菌在500~600bp之間出現(xiàn)了特異性條帶,明亮清晰,符合測序標(biāo)準(zhǔn)。
圖3 16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測圖Fig.3 The electrophoretogram of 16SrDNA amplification products
圖4 酵母菌ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of yeast ITS
由圖4可知,供試菌株Y13,N6,Y9,Y4與Pichia kudriavzevii SZCPYZJ1 同源性強(qiáng),屬于 Pichia kudriavzevii(庫德里阿茲威氏畢赤酵母)。通過系統(tǒng)發(fā)育分析4株供試菌株均屬于1個屬,且均在EC濃度為17.5g/L的培養(yǎng)基上正常生長,因此選取其中生長活性較好的菌株Y13進(jìn)行后續(xù)試驗。
2.4.1 不同碳源及碳源濃度對Y13產(chǎn)酶能力的影響
圖5 不同碳源對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響(A)和不同碳源濃度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響(B)Fig.5 Effects of different carbon sources on enzyme production ability of yeast(A)and the effects of different carbon sources concentration on enzyme production ability of yeast(B)
由圖5中A可知,在蔗糖、葡萄糖和麥芽糖3種碳源中,菌株Y13在以麥芽糖為碳源時產(chǎn)酶活性最好,其次是蔗糖,最后是葡萄糖。由此表明,雙糖比單糖更易被Y13利用。由圖5中B可知,以麥芽糖為Y13碳源,當(dāng)其濃度為10g/L時,酶活最高,這是因為碳源濃度過高會提高培養(yǎng)基中的滲透壓,抑制微生物的生長。
2.4.2 不同氮源及其濃度對Y13產(chǎn)酶能力的影響
圖6 不同氮源對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響(A)和不同氮源濃度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響(B)Fig.6 Effects of different nitrogen sources on enzyme production ability of yeast(A)and the effects of different nitrogen sources concentration on enzyme production ability of yeast(B)
由圖6中A可知,在供試的7種不同配比的氮源中,Y13在單獨(dú)以酵母粉為氮源發(fā)酵時,產(chǎn)酶的酶活最優(yōu);以酵母粉為氮源。由圖6中B可知,當(dāng)酵母粉濃度為30g/L時,Y13的發(fā)酵產(chǎn)酶能力最好。2.4.3 不同無機(jī)鹽對Y13產(chǎn)酶能力的影響
圖7 不同無機(jī)鹽對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.7 Effects of different inorganic salts on enzyme production ability of yeast
由圖7可知,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加6種不同無機(jī)鹽,以不添加無機(jī)鹽為空白對照,結(jié)果表明無機(jī)鹽的有無對Y13發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活影響不大,因此在培養(yǎng)菌株Y13時無機(jī)鹽對其影響不作考慮。
2.4.4 不同底物濃度對Y13產(chǎn)酶能力的影響
圖8 不同底物濃度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.8 Effects of different substrate concentration on enzyme production ability of yeast
在菌株Y13的搖瓶發(fā)酵試驗時,培養(yǎng)基中含有底物EC。而不同的底物濃度對菌株Y13的發(fā)酵產(chǎn)酶情況有著較大的影響。由圖8可知,底物濃度為5.00%時,Y13菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活最高。
2.5.1 接種量與培養(yǎng)時間對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響
由圖9中A可知,接種量為6%時,酵母菌的產(chǎn)酶能力最佳,且提升顯著。由圖9中B可知,隨著培養(yǎng)時間的增長,菌株的生長活性逐漸增加,當(dāng)培養(yǎng)至115h時生長活性最強(qiáng),之后隨著時間延長,生長活性也隨之降低。
圖9 不同接種量與培養(yǎng)時間對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.9 Effects of different inoculum size and culture time on yeast enzyme-producing ability
2.5.2 初始pH與裝液量對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響
由圖10中A可知,隨著初始pH值的增加,菌株的生長活性也隨之上升,當(dāng)初始pH為6時,菌株的生長活性最佳。由圖10中B可知,當(dāng)裝液量在20%時菌株的生長活性最為旺盛,但20%以后菌株的生長活性逐漸降低。
圖10 不同pH值與裝液量對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.10 Effects of different pH values and liquid volume on yeast enzyme-producing ability
2.5.3 不同溫度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響
圖11 不同溫度對酵母菌產(chǎn)酶能力的影響Fig.11 Effect of different temperatures on yeast enzyme-producing ability
由圖11可知,菌株在30℃環(huán)境下生長活性最好,與通常的酵母菌最佳生長溫度基本一致。
2.5.4 Y13菌株產(chǎn)酶條件正交試驗分析
表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table1 Optimization of orthogonal test results and analysis of enzyme production conditions
續(xù) 表
由表1正交表極差分析可知,對Y13菌株產(chǎn)酶影響的重要性為D>E>A>B>C>F,即裝液量>底物濃度>培養(yǎng)時間>初始pH>培養(yǎng)溫度>氮源濃度。由正交試驗可知菌株Y13產(chǎn)酶最佳條件為D3E2A1B3C2F2,即培養(yǎng)溫度為28℃,初始pH為6,裝液量為20%,底物濃度為5.00%,氮源濃度為30g/L的條件下培養(yǎng)120h時菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶情況最佳。綜合單因素優(yōu)化和正交優(yōu)化的結(jié)果,菌株Y13的最優(yōu)培養(yǎng)條件為:麥芽糖濃度為10g/L,酵母粉濃度為30g/L,接種量為6%,培養(yǎng)基中的底物濃度為5.00%,裝液量為20%,初始pH為6,培養(yǎng)溫度為28℃,培養(yǎng)時間為120h。
發(fā)酵食品和酒精飲料的加工過程中會產(chǎn)生EC,酒精又會促進(jìn)EC的致癌作用,隨著人們生活水平的提高,酒精飲料和發(fā)酵食品的消費(fèi)量增大,對于EC降解的研究也變得至關(guān)重要。眾多研究表明,最行之有效的方法為生物降解法,而本文就產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。篩選出菌株Y13,經(jīng)鑒定為庫德畢赤酵母,具有較好的發(fā)酵產(chǎn)酶能力,并且經(jīng)過單因素和正交試驗優(yōu)化,得到了該菌株的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件,為研究氨基甲酸乙酯的降解奠定了基礎(chǔ)。