李雄波，鄧維琴，萬(wàn)萍，張其圣，李恒，陳功＊

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 611130；2.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030；3.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106）

豆瓣醬是起源于四川民間，至今有接近300年的歷史，是一種半固態(tài)調(diào)味品［1，2］，其發(fā)酵過(guò)程經(jīng)歷多個(gè)階段，期間參與的微生物眾多，并發(fā)生了一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)［3］。豆瓣醬生產(chǎn)依舊采用開(kāi)放式發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中容易受到環(huán)境因素的影響，存在微生物代謝有害產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)。

生物胺是一種由微生物、植物和動(dòng)物代謝合成的脂肪族、芳香族或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的含氮低分子量有機(jī)堿［4］。生物胺是機(jī)體必需的內(nèi)源性組分，在細(xì)胞的增殖分化、核酸功能調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)合成、大腦和神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用［5］。然而生物胺也具有潛在的毒性，過(guò)量攝入可能會(huì)引發(fā)中毒等健康問(wèn)題［6］，其也被認(rèn)為是N-亞硝胺等致癌物的前體物質(zhì)［7］。

目前，生物胺已經(jīng)成為威脅豆瓣醬食品安全，制約豆瓣醬發(fā)展的重要因素。本文從生物胺的形成機(jī)制、危害、豆瓣醬中生物胺的產(chǎn)生條件、影響因素以及調(diào)控方法等方面進(jìn)行綜述，以期為豆瓣醬中生物胺的控制，提高豆瓣醬的安全性提供參考。

1 生物胺概述

1.1 生物胺的形成機(jī)制

食品中常見(jiàn)的8種生物胺及其相關(guān)信息見(jiàn)表1，食品中生物胺有兩個(gè)主要來(lái)源：一是原料自身帶入；二是通過(guò)氨基酸脫羧酶使得氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)形成。

表1 食品中8種生物胺［8］Table1 Information of 8biogenic amines in food

生物胺作為機(jī)體必需的生物活性成分，其存在于多數(shù)動(dòng)植物體內(nèi)，因此食品原料會(huì)自帶部分生物胺［9］。谷鳳霞測(cè)定啤酒原料麥芽、酒花和釀造用水中的生物胺含量分別為83.76，50.46，0mg／kg，證實(shí)麥芽和酒花為啤酒中生物胺的重要來(lái)源［10］。趙中輝對(duì)水產(chǎn)品貯藏中生物胺的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)新鮮的水產(chǎn)品中總胺含量也有5.19mg／kg［11］。一些新鮮原料如魚(yú)、牛奶中本身含有少量生物胺［12］。

食品中生物胺的另一個(gè)重要來(lái)源是由微生物分泌的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸形成，其作用過(guò)程見(jiàn)圖1。分泌氨基酸脫羧酶的微生物，可能來(lái)自食品原料和周?chē)h(huán)境，也可能由發(fā)酵菌劑帶入［13］。兩個(gè)基本的生理原因?qū)е挛⑸锏拿擊韧繁患せ睿阂皇强顾崦{迫，微生物在酸性環(huán)境中可以通過(guò)脫羧作用產(chǎn)生弱堿性的生物胺，最終有利于細(xì)胞內(nèi)外pH的升高［14－16］；二是獲取能量，脫羧過(guò)程可以激活與膜相關(guān)的質(zhì)子運(yùn)動(dòng)力來(lái)為細(xì)胞補(bǔ)充能量［17－19］。

圖1 氨基酸脫羧酶作用于氨基酸生成生物胺示意圖［20］Fig.1 Schematic diagram of biogenic amines formed by amino acid decarboxylase

1.2 生物胺的危害

體內(nèi)生物胺大量聚集或攝入過(guò)量的生物胺，將帶來(lái)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，因此建議攝入的食物中生物胺總量應(yīng)小于1000mg／kg。組胺是已知毒性最強(qiáng)的生物胺，有報(bào)道稱攝入8～40mg便可引起輕度中毒反應(yīng)［21］。組胺中毒的潛伏期短，表現(xiàn)為頭暈、頭痛、胸悶和無(wú)法吞咽等癥狀。酪胺引起的食物中毒最多，可能與奶酪、醬油、味噌和魚(yú)子醬等多數(shù)發(fā)酵食品中酪胺含量最高有關(guān)。酪胺具有血管收縮作用，可引起偏頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難和血壓升高。β-苯乙胺攝入3mg便可引起中毒反應(yīng)，其表現(xiàn)為頭痛、瞳孔擴(kuò)張、眼瞼組織擴(kuò)張、呼吸困難和血壓升高。尸胺和腐胺毒性低，但其能抑制生物胺氧化酶的活性，從而增強(qiáng)組胺的毒性。生物胺還被認(rèn)為是致癌物的前體物質(zhì)，如尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等可以與亞硝酸鹽反應(yīng)形成致癌物亞硝胺。

1.3 食品中生物胺的限量

目前，由于各種生物胺毒性各不相同，很難以某種生物胺或總胺的含量來(lái)衡量所有食品中生物胺的安全性，因此世界各國(guó)也只制定了部分食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)。

美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的魚(yú)類中組胺含量應(yīng)為≤50mg／kg，而其他食品中生物胺總量應(yīng)為≤1000mg／kg［22］。

歐盟只規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量應(yīng)≤100mg／kg，并建議其他食品中組胺含量應(yīng)≤100mg／kg，酪胺含量不得超過(guò)100～800mg／kg［23］。

我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2733—2015規(guī)定高組胺魚(yú)類中的組胺含量為≤400mg／kg，而其他海產(chǎn)魚(yú)的組胺含量為≤200mg／kg［24］。我國(guó)尚未制定其它食品中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此豆瓣醬中生物胺含量的安全性還沒(méi)有具體的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)理論與實(shí)際情況，學(xué)者們紛紛提出了關(guān)于食品中生物胺限量的建議。Taylor等認(rèn)為食品中總生物胺最大容許濃度為1000mg／kg［25］。

多數(shù)學(xué)者建議食品中組胺限量為50～100mg／kg；酪胺限量為100～800mg／kg［26］。Brink等建議食品中的β-苯乙胺含量應(yīng)低于30mg／kg［27］。

2 豆瓣醬中生物胺的形成

豆瓣醬發(fā)酵體系為混菌發(fā)酵，潛在產(chǎn)胺微生物較多，加之氨基酸含量豐富，因此豆瓣醬的發(fā)酵過(guò)程為微生物代謝產(chǎn)生生物胺提供了適宜的條件。

2.1 豆瓣醬中生物胺含量

豆瓣醬的產(chǎn)品特性和加工工藝決定了其存在生物胺風(fēng)險(xiǎn)。朱天傲對(duì)市場(chǎng)中5大類38種醬制品進(jìn)行了生物胺檢測(cè)，其中豆瓣醬中生物胺總量最高，總胺在131.0～451.1mg／kg之間，其中組胺和β-苯乙胺含量分別在10.2～87.8，26.4～67.5mg／kg之間［28］。根據(jù)部分限量建議，市售豆瓣醬中部分生物胺含量超過(guò)了建議限量，存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。Byun等也檢測(cè)了中國(guó)市場(chǎng)上的7種豆瓣醬，未檢出組胺，腐胺和β-苯乙胺含量最高，平均濃度分 別 為 31.71，31.27mg／kg［29］。Shukla Shruti等測(cè)定了23份韓國(guó)大醬樣品中的色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、胍丁胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的平均含量分別為18.37，82.03，70.84，34.24，47.32，26.79，126.66，74.41，244.36mg／kg［30］。從以上結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)品之間生物胺種類和含量差異較大，說(shuō)明生產(chǎn)工藝對(duì)生物胺的形成有較大影響。

2.2 豆瓣醬中生物胺形成條件

2.2.1 游離氨基酸

蠶豆是豆瓣醬最主要的原料之一，其蛋白質(zhì)含量在25%～35%之間，在食用豆類中含量?jī)H次于大豆［31，32］。豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)蛋白酶的微生物較多，制曲階段以米曲霉、黑曲霉和醬油曲霉等霉菌為主［33］；在發(fā)酵后期以芽孢桿菌等細(xì)菌為主［34］。微生物分泌大量的蛋白酶、肽酶等酶分解原料中的蛋白質(zhì)，使得豆瓣醬中氨基酸含量較高。尤新新以蠶豆為原料制作豆瓣醬，測(cè)定其發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量變化，第10天就達(dá)到0.626g／100g，發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到0.655g／100g。氨基酸是豆瓣醬風(fēng)味形成的重要物質(zhì)，其在豆瓣醬中含量豐富，這也為生物胺的形成提供了充足的前體物。

2.2.2 產(chǎn)胺微生物

豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群豐富，潛在產(chǎn)胺微生物眾多，但是對(duì)豆瓣醬中產(chǎn)胺微生物的研究鮮有報(bào)道。朱天傲從豆瓣醬中分離得到64株潛在產(chǎn)生物胺的芽孢桿菌，其在培養(yǎng)基中產(chǎn)生物胺總量為1.09～70.14mg／L。Jeon等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和腸球菌是韓國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品中生物胺的主要貢獻(xiàn)者［35］。張仁鳳等發(fā)現(xiàn)豆豉發(fā)酵常用毛霉和米曲霉的部分菌株都能產(chǎn)酪胺，部分菌株還能產(chǎn)腐胺、色胺和精胺，甚至是組胺［36］。豆瓣醬中的優(yōu)勢(shì)菌群，如曲霉、乳桿菌、芽孢桿菌、酵母、腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等都被證明是潛在的產(chǎn)胺菌屬［37，38］。

2.3 發(fā)酵條件對(duì)豆瓣醬中生物胺形成的影響

發(fā)酵溫度、pH、鹽濃度等發(fā)酵條件對(duì)生物胺的形成有不同程度的影響，其主要通過(guò)影響產(chǎn)胺微生物或者氨基酸脫羧酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)豆瓣醬中生物胺形成的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵食品中的生物胺含量有顯著影響。Bargossi等研究了溫度對(duì)從糞腸桿菌中提取的酪氨酸脫羧酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在30～37℃的溫度下脫羧效率最高［39］。周火蘭以米曲霉為種曲發(fā)酵魚(yú)露，結(jié)果表明發(fā)酵溫度40℃比30℃更有利于魚(yú)露中生物胺的生成［40］。發(fā)酵溫度越接近微生物生長(zhǎng)代謝的最適溫度，越有利于生物胺的產(chǎn)生，這是由于生物胺的產(chǎn)生與體系中存在的細(xì)胞數(shù)量有關(guān)［41］。通常豆瓣醬采用高溫發(fā)酵，有利于各種微生物生長(zhǎng)代謝，提高發(fā)酵速度，縮短生產(chǎn)時(shí)間，但由此也帶來(lái)了更高的生物胺風(fēng)險(xiǎn)。

2.3.2 環(huán)境pH對(duì)豆瓣醬中生物胺形成的影響

在酸性環(huán)境中，脫羧作用是微生物抵御酸性環(huán)境的應(yīng)激機(jī)制，通過(guò)脫羧作用產(chǎn)生堿性的生物胺，有助于提高細(xì)胞內(nèi)外的pH值。研究發(fā)現(xiàn)較低的pH值可以提高腸球菌、糞腸球菌的酪胺產(chǎn)生能力［42］。除此之外，Moreno-Arribas等研究發(fā)現(xiàn)脫羧酶的最適pH約為5.0［43］。因此，低酸環(huán)境不僅有利于微生物分泌氨基酸脫羧酶，而且酶的活性也更高。豆瓣醬發(fā)酵體系是一個(gè)弱酸環(huán)境，因此豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程的酸堿環(huán)境有利于微生物產(chǎn)生生物胺。

2.3.3 鹽濃度對(duì)豆瓣醬中生物胺形成的影響

提高鹽濃度有利于抑制微生物及其脫羧酶的活性，減少食物中生物胺的積累。Bargossi等研究了鹽濃度對(duì)純酪氨酸脫羧酶的影響，在鹽濃度達(dá)到10%時(shí)，其相對(duì)活性損失有限，只有鹽濃度達(dá)到15%時(shí)才使脫羧酶活性顯著降低，但仍具有活性。Latorre-Moratalla等發(fā)現(xiàn)3.5%～5.5%的食鹽濃度就能夠?qū)M胺的形成起到抑制作用［44］。張菁研究不同鹽度對(duì)黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)鹽度越高，黃豆醬中生物胺總量越少，且不同鹽度對(duì)產(chǎn)胺的種類也有影響［45］。

2.4 豆瓣醬中生物胺的控制方法

豆瓣醬中的生物胺形成與生產(chǎn)的衛(wèi)生狀況、工藝條件以及微生物組成有關(guān)，生物胺的積累是多種因素共同作用的結(jié)果，因此很難通過(guò)單一手段對(duì)豆瓣醬中的生物胺進(jìn)行控制。

2.4.1 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

溫度和鹽濃度等發(fā)酵條件對(duì)生物胺的形成有顯著影響。降低發(fā)酵溫度有助于降低微生物活性，可以減少生物胺的形成。另外，提高鹽濃度也有利于抑制生物胺的形成和積累，但是高鹽調(diào)味品不符合現(xiàn)在提倡的低鹽健康飲食。豆瓣醬中生物胺的含量還與原料貯藏和生產(chǎn)過(guò)程中的衛(wèi)生條件密切相關(guān)。惡劣的衛(wèi)生條件一方面造成原料在儲(chǔ)藏過(guò)程中被污染，另一方面是在發(fā)酵過(guò)程中容易受到環(huán)境微生物的污染，兩者都會(huì)造成豆瓣醬中生物胺的積累。因此，提高豆瓣醬生產(chǎn)過(guò)程中的衛(wèi)生管理和控制也是降低生物胺的重要手段。

2.4.2 安全的發(fā)酵劑

豆瓣醬中的微生物絕大部分是具有產(chǎn)胺潛力的野生菌株，因此選擇合適的原始菌株作為發(fā)酵劑是抑制生物胺積累的主要手段之一。發(fā)酵菌株的選擇應(yīng)避免有脫羧活性。此外，能分泌細(xì)菌素來(lái)抑制野生菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)胺能力，甚至能降解生物胺的菌劑是豆瓣醬發(fā)酵的較佳選擇［46］。張菁發(fā)現(xiàn)米曲霉滬釀3.042具有生物胺降解能力，選用其作為豆瓣醬的發(fā)酵劑可降低產(chǎn)品中生物胺含量。豆瓣醬發(fā)酵中乳酸菌起到重要作用，在發(fā)酵過(guò)程中添加不具備脫羧活性的乳酸菌，既可以分泌細(xì)菌素抑制其他產(chǎn)胺乳酸菌的生長(zhǎng)，還可以通過(guò)誘導(dǎo)快速酸化來(lái)抑制雜菌的污染，從而減少生物胺的形成［47］。優(yōu)良發(fā)酵菌劑的使用，不僅有利于降低生物胺的形成，而且有利于提高傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)及其穩(wěn)定性。

2.4.3 添加化學(xué)物質(zhì)抑制生物胺形成

在豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中，可以添加一些具有抗菌活性的物質(zhì)，從而改變豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中的微生物菌相結(jié)構(gòu)。鄒陽(yáng)等發(fā)現(xiàn)制曲階段是醬油中生物胺形成的重要階段，在制曲階段添加冰乙酸可以有效地降低醬油中亞精胺、精胺及組胺的積累。結(jié)果表明通過(guò)添加冰醋酸能夠有效抑制制曲階段由雜菌污染造成的生物胺積累［48］。另外，添加天然提取物來(lái)抑制食品中生物胺的產(chǎn)生也是研究的熱點(diǎn)。王永麗等發(fā)現(xiàn)大蒜提取物對(duì)假單胞菌和乳酸菌均有很強(qiáng)的抑制作用，從而大大降低了產(chǎn)品中組胺等生物胺的含量［49］。天然提取物具有安全、綠色的特點(diǎn)，其作為食品添加劑是絕佳選擇。豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程可以添加化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制生物胺的積累，但同時(shí)應(yīng)該保證豆瓣醬的品質(zhì)。

3 結(jié)論

豆瓣醬中生物胺主要是由發(fā)酵體系中復(fù)雜多樣的產(chǎn)胺微生物利用體系中豐富的氨基酸形成的。通過(guò)已有關(guān)于豆瓣醬中生物胺含量的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，部分豆瓣醬中生物胺含量超過(guò)了國(guó)際建議的食品中生物胺的限量提議，嚴(yán)重威脅到豆瓣醬的安全性。目前，關(guān)于豆瓣醬的發(fā)酵條件，如溫度、pH值、鹽濃度等對(duì)生物胺的形成和積累的影響有了部分研究報(bào)道，但是對(duì)于控制生物胺形成的方法還鮮有報(bào)道。這與豆瓣醬發(fā)酵工藝復(fù)雜、影響因素多、微生物群落高度復(fù)雜多樣、單一控制方法難以實(shí)現(xiàn)生物胺調(diào)控有關(guān)。因此，加強(qiáng)豆瓣醬中生物胺的形成機(jī)理和控制方法等方面的深入研究，對(duì)于提升豆瓣醬的品質(zhì)和安全性具有重要意義。