汪青青，李萍＊，趙鵬英，崔晶，松江勇次

（1.天津農(nóng)學院 基礎(chǔ)科學學院，天津 300384；2.天津中日水稻品質(zhì)·食味研究中心，天津 300384；3.九州大學 全球創(chuàng)新中心，日本 福岡 812-8581）

近年來，植物精油的抗菌活性及其在果蔬保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用研究引起了人們廣泛的興趣。許多植物精油的抗菌活性已經(jīng)被證實［1－3］。然而，植物精油用于果蔬保鮮面臨的最重要問題是：即使在低濃度下精油也具有強烈的氣味，這會對所處理果蔬的感官特性產(chǎn)生不利影響［4］。有報道稱，精油的復(fù)配可以擴大抗菌譜，增強抗菌效果，從而減少使用劑量（濃度），降低精油氣味給食品感官帶來的負面影響。如Ju等［5］報道了肉桂和丁香精油及其復(fù)配物對綠豆蛋糕和手指香櫞酥餅霉菌生長的抑制效果；張洪軍等［6］報道了10μL大蒜和肉桂精油按照1∶2的比例復(fù)配添加到雙孢菇PE膜包裝袋中，可有效保持雙孢菇的感官、Vc含量和總酚含量，降低褐變程度，將雙孢菇的保鮮期延長2天；劉歡等［7］報道了500μL／L的肉桂醛／檸檬醛對采后葡萄灰霉菌的穩(wěn)定抑制效果。肉桂油是從肉桂的皮、枝、葉中提取得到的黃色油狀液體，對多種食源性致病菌和果蔬腐敗性真菌具有較好的抑制效果［8，9］；八角油是從八角茴香果實中提取得到的淺黃色油狀液體，具有較強的抗菌和抗氧化活性［10］，兩者分別被中國GB 1886.207－2016和 GB 1886.140－2015 食品安全國家標準認定為安全的食品添加劑。然而，關(guān)于肉桂油和八角油的聯(lián)合抗菌作用報道很少。因此，本研究采用瓊脂-孔洞擴散法測定抗菌活性，利用2倍連續(xù)稀釋法測定精油最小抑菌濃度，以分級濃度抑制指數(shù)作為評價指標考察肉桂和八角油的聯(lián)合抗菌作用，并對兩者的最佳抗菌復(fù)配比例進行選擇，旨在通過精油的復(fù)配減弱各自的使用劑量（濃度），從而減少對食物感官特性的影響，有利于肉桂和八角精油在食品保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

肉桂油、八角油：江西吉安中大香料廠；乙酸乙酯（AR）：天津市津東天正精細化學試劑廠。革蘭氏陰性細菌：大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌；革蘭氏陽性細菌：枯草芽孢桿菌；酵母菌：啤酒酵母、釀酒酵母。以上菌種均由天津農(nóng)學院資源與環(huán)境學院微生物實驗室提供，在4℃斜面保存，用前活化2次。

1.2 儀器與設(shè)備

DX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；Thermo Scientific MSC-AdvantageⅡ級生物安全柜 德國 Thermo Fisher Scientific公司；LRH-250-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠。UV-1800型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 瓊脂-孔洞擴散法測定抗菌活性

供試樣品溶液的配制：肉桂油、八角油分別用乙酸乙酯溶解，初始濃度為1000.0mg／mL，用乙酸乙酯作溶劑，采用2倍連續(xù)稀釋法配成一系列不同濃度的樣品溶液。

菌懸液的制備：細菌用平板計數(shù)法測定菌落數(shù)，酵母用血球計數(shù)法計算菌落數(shù)［11］。將活化后的細菌和酵母菌用無菌水稀釋，分別制成含菌數(shù)為107cfu／mL的菌懸液。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細菌用）；酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌用）。

測定步驟［12］：滅菌培養(yǎng)基冷至50℃，加入5mL菌懸液，混勻，倒入培養(yǎng)皿中（直徑9cm），每皿20mL，固化45min。用無菌打孔器在培養(yǎng)基上均勻打孔（直徑9mm），記號。每孔加入40μL供試樣品溶液，乙酸乙酯作空白對照，每個濃度重復(fù)3次。細菌于37℃培養(yǎng)24h，酵母菌于28℃培養(yǎng)48h。以十字交叉法測量抑菌圈直徑，結(jié)果用平均值±標準差表示，單位mm。

最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）定義為可以完全抑制供試菌種生長的最低濃度。1.3.2 肉桂油和八角油聯(lián)合抗菌作用評價

精油的聯(lián)合抗菌作用分為：協(xié)同、相加、無相關(guān)和拮抗作用4種。采用二維棋盤試驗測定肉桂油和八角油兩者復(fù)配的聯(lián)合抗菌作用［13］。肉桂油的供試濃度為：MIC，1／2MIC，1／4MIC，1／8MIC，1／16MIC；八角 油 的 供 試 濃 度 為：MIC，1／2MIC，1／4MIC，1／8MIC；兩兩組合，共20組。以分級濃度抑制指數(shù)（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）作為聯(lián)合抗菌作用的判定依據(jù)。FIC按照如下公式計算：

FIC≤0.5：協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1.0：相加作用；1.0＜FIC＜4.0：無相關(guān)作用；FIC≥4.0：拮抗作用。

1.3.3 肉桂油和八角油最佳抑菌復(fù)配比例的選擇

選取對肉桂和八角復(fù)配精油敏感的供試菌種（即協(xié)同或相加作用），對精油最佳抑菌復(fù)配比例進行選擇，體積比例（肉桂油∶八角油）分別設(shè)置為4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂油和八角油單方的最小抑菌濃度（MIC）

肉桂油和八角油單方對供試菌種的抑制效果見表1。

表1 肉桂油和八角油對供試菌種的抑菌圈直徑（mm）Table1 The inhibition zone diameter（mm）of cinnamon oil and star anise oil on the tested strains

由表1可知，濃度為1000.0mg／mL的肉桂油對供試細菌的抑菌圈直徑是相同濃度八角油的2.50～2.68倍，對供試酵母菌的抑菌圈直徑是相同濃度八角油的2.77～2.97倍。說明在同一試驗條件下，相同濃度的肉桂油抑菌效果好于八角油，這與 Wang等［14］的研究結(jié)果一致。肉桂油對供試酵母菌和細菌的MIC分別為31.25，125.0mg／mL，說明對酵母菌的抑制效果好于細菌，鄧靖等［15］報道了相同的研究結(jié)果。此外，肉桂油對啤酒酵母的抑制效果優(yōu)于釀酒酵母，而對6種供試細菌的抑制效果相差不大。八角油對供試酵母菌和細菌的抑制活性相差不大，MIC均為1000.0mg／mL。我們報道的肉桂油對大腸桿菌的抑菌圈直徑（28.90±0.94）mm與柴向華等報道的一致［16］，而對啤酒酵母的抑制效果與柴向華等報道的相差較大。精油的抑菌活性受到多種因素影響，如來源、萃取方法、使用濃度、菌種、菌懸液濃度、抑菌活性評價方法等。

2.2 肉桂油和八角油的聯(lián)合抗菌作用

采用二維棋盤試驗將肉桂油和八角油供試濃度進行兩兩組合，得到兩者聯(lián)合使用時的最小抑菌濃度組合并結(jié)合兩者各自的最小抑菌濃度計算FIC值，結(jié)果見表2。

表2 肉桂油和八角油聯(lián)合抗菌作用Table2 Combined antibacterial effect of cinnamon and star anise oil

續(xù) 表

由FIC值可以判斷，肉桂油和八角油聯(lián)合使用對嗜水氣單胞菌的抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用（FIC＝0.375），對惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌表現(xiàn)出相加作用（FIC＝0.625），對大腸桿菌（FIC＝1.25）、產(chǎn)氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌均無相關(guān)作用（FIC＝1.5），對啤酒酵母和釀酒酵母表現(xiàn)出無相關(guān)作用（FIC＝2.0），對所有供試菌種均無拮抗作用。關(guān)于肉桂油與其他精油的聯(lián)合抗菌活性已有報道，如Siddiqua等［17］報道了肉桂醛和丁香精油組合對大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑制效果；許倩等［18］報道了肉桂和紫蘇精油復(fù)配對冬棗常見致病菌青霉和黑曲霉的明顯抑制效果；Nikkhah等［19］報道了肉桂和百里香精油聯(lián)合使用具有協(xié)同抗菌效果（FIC＜0.5），且對梨腐敗真菌的抑制效果好于2種精油單方使用，而關(guān)于肉桂與八角油的聯(lián)合抗菌作用報道很少。

2.3 肉桂油和八角油最佳抑菌復(fù)配比例的選擇

2.3.1 肉桂油和八角油不同比例復(fù)配精油的紫外波長掃描

肉桂和八角及其不同比例復(fù)配精油的紫外波長掃描結(jié)果見圖1，最大吸收波長見表3。

圖1 肉桂油和八角及其不同比例復(fù)配精油的紫外光譜掃描Fig.1 Ultraviolet spectrum scanning of cinnamon and star anise and their different proportions of essential oils

表3 肉桂和八角及其不同比例復(fù)配精油的紫外最大吸收波長Table3 UV absorption maximum wavelength of cinnamon and star anise and their different proportions of essential oils

由圖1和表3可知，肉桂油和八角油單方的乙酸乙酯溶液紫外最大吸收分別在282.5，259.5nm，復(fù)配精油的最大吸收處于2種精油的單方吸收之間。還可以看出，肉桂油和八角油復(fù)配比例不同，最大吸收波長發(fā)生移動，說明不同比例精油復(fù)配后其化學組成發(fā)生變化，推斷其抑菌活性也會發(fā)生改變，因此，對肉桂油和八角油最佳抑菌復(fù)配比例進行了選擇。

2.3.2 肉桂油和八角油最佳抑菌復(fù)配比例的選擇

根據(jù)前述聯(lián)合抗菌作用研究結(jié)果，肉桂和八角復(fù)配精油對嗜水氣單胞菌的抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用，對惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌的抑制表現(xiàn)出相加作用。因此，以此3種細菌為供試菌種，對2種精油的最佳抑菌復(fù)配比例進行了選擇，結(jié)果見表4。

表4 肉桂油和八角油最佳抑菌復(fù)配比例的選擇（抑菌圈直徑：mm）Table4 Selection of the best combined antibacterial ratio of cinnamon oil and star anise oil（inhibition zone diameter：mm）

續(xù) 表

由表4可知，復(fù)配體積比例在4∶1～1∶1（肉桂油∶八角油）時，對3種菌種都表現(xiàn)出抑制效果，抑菌圈直徑在18.29～13.25mm范圍內(nèi)變化，且對3個菌種的最佳抑菌復(fù)配比例均為3∶1（肉桂油∶八角油）。體積比例在1∶2～1∶4（肉桂油∶八角油）時，復(fù)配精油對供試菌種都沒有表現(xiàn)出抑制效果，即沒有抑菌圈。上述結(jié)果說明，在復(fù)配精油中肉桂油所占比例超過50.0%時，具有抑菌效果，而八角油所占比例超過66.7%時，復(fù)配精油對供試菌種沒有抑制效果。由此可以推斷，在復(fù)配精油中起主要抑菌作用的是肉桂油，少量八角油對肉桂油的抑菌活性起到協(xié)同或相加作用。這與前面2種精油單方使用時的抑菌結(jié)果相一致，即在同一試驗條件下，濃度相同的肉桂油抑菌效果好于八角油，肉桂油對供試酵母菌和細菌的MIC分別為31.25，125.0mg／mL，而八角油對供試細菌和酵母菌的MIC均為1000.0mg／mL，分別是肉桂油 MIC的32倍（酵母菌）和8倍（細菌）。肉桂油的主要化學組成成分是肉桂醛，肉桂醛具有顯著的抗菌效果［20］。八角油的主要化學組成成分是茴香腦，茴香腦的抑菌效果較弱［21，22］。

2.3.3 肉桂油和八角油單方和聯(lián)合使用抑菌效果對照

對肉桂油和八角油單方及復(fù)配抑菌效果進行比較，結(jié)果見表5。

表5 肉桂油和八角油單方和聯(lián)合使用抑菌效果對照Table5 Comparison of antibacterial effect of cinnamon oil and star anise oil alone and in combination

由表5可知，濃度為31.25mg／mL的肉桂油和濃度為125.0mg／mL的八角油按照3∶1復(fù)配后對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑大于濃度為250.0mg／mL的肉桂油和1000.0mg／mL的八角油單方使用時的抑菌圈直徑；濃度為62.5mg／mL的肉桂油和濃度為125.0mg／mL的八角油按照3∶1復(fù)配后對惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌的抑菌圈直徑大于濃度為250.0mg／mL的肉桂油和1000.0mg／mL的八角油單方使用時的抑菌圈直徑。上述結(jié)果表明，肉桂油和八角油復(fù)配后對供試菌種的抑制活性增強，并可以降低各自的使用濃度（劑量），用于果蔬保鮮，可以減弱對果蔬感官特性的負面影響。

3 結(jié)論

肉桂油對供試酵母和細菌的MIC分別為31.25，125.0mg／mL，八角油對供試酵母和細菌的MIC均為1000.0mg／mL，肉桂油單方使用時的抑菌效果好于相同濃度的八角油。肉桂油和八角油按1∶1體積比復(fù)配使用時，對嗜水氣單胞菌的抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用（FIC＝0.375），對惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌表現(xiàn)出相加作用（FIC＝0.625），對所有供試菌種均無拮抗作用。肉桂油和八角油復(fù)配比例變化，抑菌活性也會發(fā)生改變?；旌暇椭校斎夤鹩退俭w積比例超過50.0%時，對嗜水氣單胞菌、惡臭假單胞菌和熒光假單胞菌表現(xiàn)出抑制效果，且對3個菌種的最佳抑菌復(fù)配比例均為3∶1，八角油所占比例超過66.7%時，復(fù)配精油對供試3個菌種沒有抑制效果。綜上，肉桂油和八角油聯(lián)合使用可以增強抑菌活性，降低各自的使用濃度（劑量），從而可以減弱用作保鮮劑時對果蔬感官特性的負面影響。